本文選題：體外心臟震波治療　切入點(diǎn)：急性心肌梗死　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：心肌缺血導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡在冠心病心肌細(xì)胞數(shù)目減少和功能損傷中起重要作用。心臟震波治療(Cardiac Shock Wave Therapy, CSWT)是國際上新近發(fā)展起來的嚴(yán)重冠心病治療方法。國內(nèi)外研究結(jié)果顯示,CSWT可以通過促進(jìn)缺血心肌血管新生、減輕炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激等機(jī)制改善心肌血流灌注,減輕左室重構(gòu),改善左心功能。但CSWT對缺血后心肌細(xì)胞凋亡的作用和機(jī)制少有報(bào)道。我們前期的研究證實(shí)震波治療可以減輕缺血缺氧誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡。在前期細(xì)胞學(xué)研究的基礎(chǔ)上,我們采用大鼠急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction, AMI)模型進(jìn)一步探討CSWT對AMI后心肌細(xì)胞凋亡的影響及可能的調(diào)控機(jī)制；我們還將通過組織、細(xì)胞及分子等水平評估CSWT的安全性,為CSWT治療缺血性心臟病提供新思路及基礎(chǔ)理論依據(jù)。方法：1選用2月齡的雄性Wistar大鼠,通過結(jié)扎冠狀動脈左前降支建立AMI模型。2采用Western blot方法分別檢測AMI 6h、12h、24h、36h、48h后梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3)的表達(dá)；以末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測定法(transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling, TUNEL)檢測心肌細(xì)胞凋亡率。3對AMI后12h的大鼠模型分別施加600次、800次、1000次的震波不同劑量，Western blot方法檢測梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax、 Cleaved-Caspase-3)的表達(dá)。4對AMI后12h大鼠模型進(jìn)行震波治療(能量：0.1mJ/mm2,次數(shù)：800次,頻率：4Hz),AMI后36h處死大鼠,收集心臟標(biāo)本。標(biāo)本的石蠟切片進(jìn)行H＆E染色；TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡率；Western blot法檢測梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞線粒體與胞漿中細(xì)胞色素C(Cytochrome C, Cyt C)的含量、凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax、 Cleaved-Caspase-3)的表達(dá)以及JNK、p38MAPK、Akt信號通路蛋白的磷酸化水平。5對Wistar大鼠進(jìn)行震波處理(能量：0.1mJ/mm2,次數(shù)：800次,頻率：4Hz),處理前、后分別記錄大鼠心電圖,檢測血壓、心率,24h后處死大鼠,收集心臟標(biāo)本。標(biāo)本的石蠟切片行蘇木素-伊紅(Hematoxylin and Eosin, H E)染色,觀察心肌組織病理學(xué)改變；TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡率；Western blot法檢測心肌細(xì)胞線粒體與胞漿中Cyt C的含量、凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3)的表達(dá)以及JNK、p38MAPK、Akt信號通路蛋白的磷酸化水平。結(jié)果：1、 AMI大鼠模型體外心臟震波治療方法的建立1.1成功建立大鼠AMI模型,存活率為75.4%,死亡率為24.6%,存活模型的成功率為93.9%。1.2探討震波治療時(shí)機(jī)分別于AMI 6h、12h、24h、36h、48h觀察梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞的凋亡,TUNEL檢測結(jié)果顯示正常對照組(NC組)、AMI 6h、12h、24h、36h、48h的心肌細(xì)胞凋亡率分別為4.31%、8.16%、19.96%、30.96%、48.59%、69.28%,其中AMI 12h心肌細(xì)胞的凋亡率較NC組顯著升高(P0.01),但明顯低于AMI 24h和36h(P0.01),提示AMI 12h細(xì)胞凋亡已明顯增加但尚未發(fā)生大量凋亡,同時(shí)Bax蛋白的表達(dá)(2.69±0.44)較NC組(1.00±0.34)開始顯著升高,提示凋亡上游信號通路啟動明顯增強(qiáng),因此選取AMI 12h作為后續(xù)研究震波治療的時(shí)間點(diǎn)。1.3探討震波治療次數(shù)分別嘗試600次、800次、1000次的震波次數(shù)對AMI大鼠模型進(jìn)行震波治療,結(jié)果顯示,與心肌梗死組比較,各震波次數(shù)組梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白均明顯升高,Bax及Cleaved-Caspase-3蛋白均明顯降低。其中,應(yīng)用800次震波時(shí),Bcl-2蛋白的表達(dá)最高、Bax與Cleaved-Caspase-3蛋白的表達(dá)最低。因此后續(xù)研究選取800次進(jìn)行震波治療。2、CSWT對AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制探討實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組(sham組)、假手術(shù)+震波組(sham+SW組)、心肌梗死組(AMI組)、心肌梗死+震波組(AMI+SW組)2.1 H E染色結(jié)果顯示,與sham組比較,AMI組梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞空泡樣變性、壞死,炎性細(xì)胞浸潤,AMI+SW組可見類似改變。2.2 TUNEL檢測結(jié)果顯示,sham組、AMI組、AMI+SW組梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞凋亡率分別為7.52±1.24%、48.92±5.13%、25.33±3.55%,AMI組較sham組明顯升高(P0.01),震波治療則可以明顯降低心肌細(xì)胞的凋亡率(P0.01)。2.3 Western blot結(jié)果顯示,sham組、AMI組、AMI+SW組梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞線粒體Cyt C含量分別為：1.00±0.19、0.42±0.06、0.93±0.20；胞漿Cyt C分別為：1.00±0.12、4.91±0.71、2.68±0.70。與sham組比較,AMI組心肌細(xì)胞線粒體Cyt C含量明顯減少,胞漿Cyt C含量明顯增高；震波治療可以明顯抑制AMI后心肌細(xì)胞cyt C從線粒體向胞漿的轉(zhuǎn)移,結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示CSWT可以保護(hù)AMI后心肌細(xì)胞線粒體膜通透性,抑制Cyt C的釋放,具有線粒體保護(hù)作用。2.4 Western blot結(jié)果顯示,sham組、AMI組、AMI+SW組梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)分別為1.00±0.11、0.80±0.14、1.09±0.11；Bax蛋白的表達(dá)分別為：1.00±0.16、4.95±0.45、3.09±0.30；Cleaved-Caspase-3蛋白的表達(dá)分別為：1.00±0.11、4.36±0.71、1.72±0.33。與sham組比較,AMI組心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯下調(diào),Bax以及Cleaved-Caspase-3蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)；震波治療可以明顯上調(diào)AMI后Bcl-2蛋白的表達(dá),下調(diào)Bax, Cleaved-Caspase-3蛋白的表達(dá),結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.5 Western blot結(jié)果顯示,sham組、AMI組、AMI+SW組JNK蛋白的磷酸化水平分別為：1.00±0.08、2.23±0.72、0.78±0.21；p38MAPK蛋白的磷酸化水平分別為：1.00±0.04、1.49±0.16、1.25±0.24；Akt蛋白的磷酸化水平分別為：1.00±0.09、0.41±0.09、0.38±0.09。與sham組比較,AMI后梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞JNK. p38MAPK蛋白的磷酸化水平明顯升高,Akt蛋白的磷酸化水平明顯降低；震波治療后,與AMI組比較,JNK蛋白的磷酸化水平明顯下降(P0.01),p38MAPK與Akt蛋白的磷酸化水平無明顯變化。提示AMI后心肌細(xì)胞凋亡、炎癥相關(guān)信號通路激活,震波治療可能通過抑制JNK信號通路從而抑制AMI后心肌細(xì)胞的凋亡,達(dá)到心肌保護(hù)作用。3、CSWT的心臟安全性研究大鼠心肌的正常對照組(NC組)與正常對照+震波組(NC+SW組)結(jié)果顯示：3.1 H E染色結(jié)果顯示,震波治療后心肌細(xì)胞無變性壞死,心肌間質(zhì)無炎癥細(xì)胞浸潤。3.2 TUNEL檢測結(jié)果顯示,兩組心肌細(xì)胞凋亡率無明顯差異(P=0.71)。3.3兩組心肌細(xì)胞線粒體Cyt C含量(P=0.10)及胞漿Cyt C含量(P=0.76)無明顯變化。3.4兩組Bcl-2、Bax及Cleaved-Caspase-3蛋白的表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值分別為0.12、0.66、0.42)；JNK、p38MAPK及Akt信號通路蛋白磷酸化水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值分別為0.07、0.69、0.74)。3.5治療前、后大鼠心電圖未觀察到異常改變。兩組大鼠的血壓、心率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：1 AMI后梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞線粒體Cyt C向胞漿釋放增加,Bax與Cleaved-Caspase-3的表達(dá)上調(diào),Bcl-2的表達(dá)下調(diào),促進(jìn)大鼠心肌細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致AMI后心肌細(xì)胞的損失和功能降低。2 CSWT可以減少AMI后梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞線粒體Cyt C向胞漿釋放,降低Bax與Cleaved-Caspase-3的表達(dá),升高Bcl-2的表達(dá),減輕AMI后心肌細(xì)胞的凋亡。3 CSWT可能通過抑制JNK信號通路,從而抑制凋亡信號的激活,達(dá)到心肌保護(hù)的作用。4治療劑量的SW對大鼠是安全的方法。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R542.22

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本文編號：1647190