本文選題：創(chuàng)面愈合　切入點：CD9　出處：《第三軍醫(yī)大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景創(chuàng)面愈合是一個動態(tài)且受到嚴格精準調(diào)控的生物學過程。再上皮化主要涵蓋表皮細胞向創(chuàng)面中心遷移的過程,是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Tetraspanin CD9表達于皮膚表皮中且我們前期通過動物實驗研究發(fā)現(xiàn)CD9基因敲除小鼠皮膚創(chuàng)面愈合速度明顯受抑制,表明CD9參與皮膚創(chuàng)面愈合的調(diào)控。然而,皮膚損傷后可激活多條細胞內(nèi)及細胞間的信號通路,且包括角質(zhì)化細胞,炎性細胞,內(nèi)皮細胞,成纖維細胞等在內(nèi)的多種細胞類型也會被調(diào)動參與創(chuàng)面愈合過程。這些細胞均會在基因表達或細胞表型上發(fā)生改變,促進細胞增殖、遷移或分化等過程,以參與創(chuàng)面愈合過程。因此,CD9是否通過調(diào)節(jié)表皮細胞遷移及其胞內(nèi)信號通路介導創(chuàng)面愈合調(diào)控仍不清楚。大量研究表明基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9)參與創(chuàng)面愈合過程中表皮細胞遷移的調(diào)控。我們前期研究結(jié)果也表明CD9下調(diào)可通過激活MMP-9介導表皮細胞遷移的調(diào)節(jié)。Tetraspanins分子家族的重要特征之一就是同整合素分子結(jié)合,并啟動下游信號通路。CD9也被發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)面愈合過程中受到嚴密的調(diào)控并參與整合素分子的調(diào)節(jié)。整合素αvβ6被證明可促進角膜創(chuàng)面愈合、上調(diào)MMP-9并可促進正�？谇火つけ砥ぜ毎w移。有證據(jù)表明皮膚創(chuàng)面愈合過程中再上皮化過程同整合素αvβ5及αvβ6間的轉(zhuǎn)換有關(guān)。此外,在創(chuàng)面愈合過程中或皮膚表皮細胞角化過程中,表皮細胞均存在分化狀態(tài)及運動性間平衡的調(diào)節(jié)。而我們前期研究也證明CD9可通過在創(chuàng)面愈合不同的階段的差異性表達介導表皮細胞遷移的調(diào)節(jié)。雖然CD9被證明參與創(chuàng)面再上皮化過程且在皮膚創(chuàng)面愈合過程中其表達水平受嚴格的時空調(diào)控,即創(chuàng)面形成后其表達明顯下調(diào),當創(chuàng)面再上皮化完成時其表達又恢復至正常皮膚表皮中水平,然而CD9在創(chuàng)面愈合過程其表達調(diào)控的具體機制也仍不清楚。事實上,急性皮膚組織損傷后創(chuàng)面微環(huán)境呈低氧環(huán)境且創(chuàng)緣組織氧濃度的這一變化過程同創(chuàng)面愈合過程中CD9的表達變化成良好的契合。因此,本研究將檢測CD9對表皮細胞遷移的影響,并進一步探討創(chuàng)面愈合過程中CD9對表皮細胞中MMP-9表達的調(diào)節(jié)以及整合素在其中的作用;同時,也將從表皮細胞分化狀態(tài)及運動性間平衡的角度探討CD9對表皮細胞移行的調(diào)控作用。此外,我們還將通過建立體外表皮細胞缺氧模型,明確創(chuàng)面愈合過程中cd9表達變化的分子機制,從而揭示cd9調(diào)節(jié)創(chuàng)面表皮細胞移行的作用機理,為揭示創(chuàng)面愈合規(guī)律的認識提供新的視角。研究方法1.利用小鼠皮膚制作在體創(chuàng)面愈合模型,同時使用hacat表皮細胞及正常人皮膚角質(zhì)化細胞片層劃痕制作體外細胞創(chuàng)面愈合模型。使用免疫熒光染色檢測創(chuàng)緣移行表皮細胞中cd9的表達變化。使用重組腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)制作cd9高表達或干擾表達的表皮細胞模型,然后進行劃痕檢測及細胞遷移分析以觀察cd9對表皮細胞遷移的影響。此外,還利用明膠酶譜法及elisa法檢測cd9調(diào)控的表皮細胞培養(yǎng)上清液中mmp-9的活性變化,并利用蛋白免疫印跡法檢測細胞中mmp-9的表達變化。mmp-9的選擇性抑制劑或sp600125(10μm)被用來處理表皮細胞,以檢測mmp-9在cd9調(diào)節(jié)的表皮細胞遷移中的作用或用來檢測jnk信號通路在cd9介導mmp-9調(diào)節(jié)中的作用。2.同上述方法制作cd9高表達或干擾表達的hacat表皮細胞模型,然后運用wb法檢測cd9調(diào)控后的hacat表皮細胞中整合素亞基的表達變化。同時提取hacat表皮細胞的細胞膜蛋白使用免疫共沉淀技術(shù)檢測整合素亞基間的結(jié)合變化。免疫熒光染色及流式細胞學技術(shù)均被用來檢測表皮細胞膜上整合素αvβ5及αvβ6的分布變化。另外,整合素功能阻斷劑10d5和p1f6(10μg/ml)也被分別用來觀察整合素αvβ5或αvβ6在cd9介導的表皮細胞mmp-9激活及遷移中的作用。3.hacat表皮細胞及原代小鼠皮膚表皮細胞(mks)進行高鈣處理(1.2mm)24h建立表皮細胞分化模型,然后使用wb法檢測cd9的表達變化。使用活細胞工作站動態(tài)拍攝技術(shù)觀察單個表皮細胞的運動性,并使用imagej軟件進行分析;cd9高表達或干擾表達mks分別于低鈣或高鈣條件下培養(yǎng)24h,觀察cd9對表皮細胞直徑及鋪展面積的影響,同時使用wb法檢測分化標記物(ck1,ck10,loricrin和filaggrin)的表達變化。免疫熒光染色被用來觀察e-cadherin介導的細胞間粘附,而wb法及ip技術(shù)被用來檢測cd9調(diào)控的表皮細胞中pi3k信號通路激活情況。使用e-cadherinsirna或ly294002處理低鈣條件培養(yǎng)的cd9高表達表皮細胞,以觀察其對cd9調(diào)控的表皮細胞分化及運動性的影響。使用jnk信號通路抑制劑sp600125處理cd9干擾表達的表皮細胞以檢測jnk信號通路在e-cadherin向細胞膜上募集中的作用。此外,ihc法觀察ck10及e-cadherin在cd9基因敲除的小鼠皮膚表皮細胞膜上表達變化。4.hacat表皮細胞及原代小鼠皮膚表皮細胞(mks)進行缺氧處理(2%o2)12h、24h及36h,然后使用wb及real-timepcr技術(shù)檢測cd9水平變化。重組腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)制作cd9高表達或干擾表達的hacat表皮細胞模型再進行缺氧處理,然后使用劃痕法及活細胞工作站動態(tài)攝像技術(shù)觀察cd9對缺氧hacat細胞的作用。wb法檢測p38/mapk信號通路激活情況并使用sb203580或mkk6(glu)轉(zhuǎn)染調(diào)節(jié)缺氧表皮細胞中p38/mapk信號通路后,wb法檢測cd9表達變化。同時使用細胞劃痕分析及細胞遷移分析法檢測p38/mapk信號通路在cd9調(diào)節(jié)的缺氧表皮細胞遷移中的作用。結(jié)果1.在體或離體創(chuàng)面愈合模型中創(chuàng)緣移行表皮細胞中cd9的表達均下調(diào),且cd9的下調(diào)表達可促進表皮細胞移行,而cd9的高表達作用則相反。cd9可負向調(diào)控表皮細胞中mmp-9的活性及蛋白水平。cd9低表達激活的jnk信號通路也參與上調(diào)表皮細胞中mmp-9的活性及表達,而sp600125抑制jnk信號通路后卻可使cd9干擾的表皮細胞中mmp-9活性及蛋白水平下調(diào)。2.cd9可調(diào)節(jié)表皮細胞中β5和β6的表達,且cd9干擾后可促進表皮細胞中αvβ5向αvβ6的轉(zhuǎn)換,而cd9高表達卻可逆轉(zhuǎn)這一轉(zhuǎn)換過程。使用10d5對整合素αvβ6進行功能阻斷后可顯著抑制cd9下調(diào)誘導的表皮細胞遷移及mmp-9激活。3.分化的表皮細胞中cd9的表達明顯提高;且cd9高表達可促進表皮細胞分化并抑制其運動性;而cd9干擾后可抑制高鈣誘導的表皮細胞分化過程并提高細胞的運動性。cd9上調(diào)后可促進e-cadherin向細胞膜上募集并激活下游pi3k信號通路,而cd9干擾后可抑制這一過程。另外,e-cadherin干擾后或pi3k信號通路受抑后均可逆轉(zhuǎn)cd9上調(diào)誘導的表皮細胞分化及運動性下降。4.缺氧可下調(diào)cd9在表皮細胞中的表達水平并促進細胞遷移;而cd9高表達可抑制缺氧促進的表皮細胞遷移作用。缺氧還可激活p38/mapk信號通路;使用sb203580可上調(diào)表皮細胞中cd9的蛋白水平并下調(diào)缺氧條件下表皮細胞的遷移速率;而使用mkk6(glu)腺病毒轉(zhuǎn)染促進p38/mapk信號通路激活后,卻可使cd9表達下調(diào)并促進缺氧條件下表皮細胞的遷移。結(jié)論1.cd9在體內(nèi)及體外創(chuàng)面愈合模型的移行表皮細胞中均呈下調(diào)表達,且cd9的低表達可促進表皮細胞的遷移,mmp-9參與了cd9介導的表皮細胞遷移調(diào)控,激活jnk通路可使mmp-9活化,顯著促進cd9介導的表皮細胞遷移。2.下調(diào)cd9表達可促進皮膚表皮細胞中整合素ανβ5向ανβ6的轉(zhuǎn)化,而整合素αvβ5和αvβ6間的轉(zhuǎn)換在cd9介導的表皮細胞遷移及mmp-9激活調(diào)節(jié)過程中均起重要作用。3.CD9可調(diào)控表皮細胞分化狀態(tài)及運動性間的平衡,且其介導的E-cadherin向細胞膜上的募集及下游PI3K信號的激活在這一過程中起重要調(diào)節(jié)作用。4.缺氧可明顯下調(diào)表皮細胞中CD9的表達而促進表皮細胞遷移,p38通路在CD9介導缺氧誘導的表皮細胞遷移調(diào)控中起重要作用。本研究深化了對CD9在創(chuàng)面愈合中作用的認識,也為揭示創(chuàng)面愈合規(guī)律提供了新的視角,并為創(chuàng)面愈合的臨床治療提供了新的可能的分子靶點。
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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R641

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;KAI1/CD82 suppresses hepatocyte growth factorinduced migration of hepatoma cells via upregulationof Sprouty2[J];Science in China(Series C:Life Sciences);2008年07期

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本文編號：1603968