本文選題：創(chuàng)面愈合　切入點(diǎn)：CD9　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景創(chuàng)面愈合是一個(gè)動(dòng)態(tài)且受到嚴(yán)格精準(zhǔn)調(diào)控的生物學(xué)過程。再上皮化主要涵蓋表皮細(xì)胞向創(chuàng)面中心遷移的過程,是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Tetraspanin CD9表達(dá)于皮膚表皮中且我們前期通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)CD9基因敲除小鼠皮膚創(chuàng)面愈合速度明顯受抑制,表明CD9參與皮膚創(chuàng)面愈合的調(diào)控。然而,皮膚損傷后可激活多條細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的信號(hào)通路,且包括角質(zhì)化細(xì)胞,炎性細(xì)胞,內(nèi)皮細(xì)胞,成纖維細(xì)胞等在內(nèi)的多種細(xì)胞類型也會(huì)被調(diào)動(dòng)參與創(chuàng)面愈合過程。這些細(xì)胞均會(huì)在基因表達(dá)或細(xì)胞表型上發(fā)生改變,促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移或分化等過程,以參與創(chuàng)面愈合過程。因此,CD9是否通過調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞遷移及其胞內(nèi)信號(hào)通路介導(dǎo)創(chuàng)面愈合調(diào)控仍不清楚。大量研究表明基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9)參與創(chuàng)面愈合過程中表皮細(xì)胞遷移的調(diào)控。我們前期研究結(jié)果也表明CD9下調(diào)可通過激活MMP-9介導(dǎo)表皮細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)。Tetraspanins分子家族的重要特征之一就是同整合素分子結(jié)合,并啟動(dòng)下游信號(hào)通路。CD9也被發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)面愈合過程中受到嚴(yán)密的調(diào)控并參與整合素分子的調(diào)節(jié)。整合素αvβ6被證明可促進(jìn)角膜創(chuàng)面愈合、上調(diào)MMP-9并可促進(jìn)正常口腔黏膜表皮細(xì)胞遷移。有證據(jù)表明皮膚創(chuàng)面愈合過程中再上皮化過程同整合素αvβ5及αvβ6間的轉(zhuǎn)換有關(guān)。此外,在創(chuàng)面愈合過程中或皮膚表皮細(xì)胞角化過程中,表皮細(xì)胞均存在分化狀態(tài)及運(yùn)動(dòng)性間平衡的調(diào)節(jié)。而我們前期研究也證明CD9可通過在創(chuàng)面愈合不同的階段的差異性表達(dá)介導(dǎo)表皮細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)。雖然CD9被證明參與創(chuàng)面再上皮化過程且在皮膚創(chuàng)面愈合過程中其表達(dá)水平受嚴(yán)格的時(shí)空調(diào)控,即創(chuàng)面形成后其表達(dá)明顯下調(diào),當(dāng)創(chuàng)面再上皮化完成時(shí)其表達(dá)又恢復(fù)至正常皮膚表皮中水平,然而CD9在創(chuàng)面愈合過程其表達(dá)調(diào)控的具體機(jī)制也仍不清楚。事實(shí)上,急性皮膚組織損傷后創(chuàng)面微環(huán)境呈低氧環(huán)境且創(chuàng)緣組織氧濃度的這一變化過程同創(chuàng)面愈合過程中CD9的表達(dá)變化成良好的契合。因此,本研究將檢測(cè)CD9對(duì)表皮細(xì)胞遷移的影響,并進(jìn)一步探討創(chuàng)面愈合過程中CD9對(duì)表皮細(xì)胞中MMP-9表達(dá)的調(diào)節(jié)以及整合素在其中的作用;同時(shí),也將從表皮細(xì)胞分化狀態(tài)及運(yùn)動(dòng)性間平衡的角度探討CD9對(duì)表皮細(xì)胞移行的調(diào)控作用。此外,我們還將通過建立體外表皮細(xì)胞缺氧模型,明確創(chuàng)面愈合過程中cd9表達(dá)變化的分子機(jī)制,從而揭示cd9調(diào)節(jié)創(chuàng)面表皮細(xì)胞移行的作用機(jī)理,為揭示創(chuàng)面愈合規(guī)律的認(rèn)識(shí)提供新的視角。研究方法1.利用小鼠皮膚制作在體創(chuàng)面愈合模型,同時(shí)使用hacat表皮細(xì)胞及正常人皮膚角質(zhì)化細(xì)胞片層劃痕制作體外細(xì)胞創(chuàng)面愈合模型。使用免疫熒光染色檢測(cè)創(chuàng)緣移行表皮細(xì)胞中cd9的表達(dá)變化。使用重組腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)制作cd9高表達(dá)或干擾表達(dá)的表皮細(xì)胞模型,然后進(jìn)行劃痕檢測(cè)及細(xì)胞遷移分析以觀察cd9對(duì)表皮細(xì)胞遷移的影響。此外,還利用明膠酶譜法及elisa法檢測(cè)cd9調(diào)控的表皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中mmp-9的活性變化,并利用蛋白免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞中mmp-9的表達(dá)變化。mmp-9的選擇性抑制劑或sp600125(10μm)被用來處理表皮細(xì)胞,以檢測(cè)mmp-9在cd9調(diào)節(jié)的表皮細(xì)胞遷移中的作用或用來檢測(cè)jnk信號(hào)通路在cd9介導(dǎo)mmp-9調(diào)節(jié)中的作用。2.同上述方法制作cd9高表達(dá)或干擾表達(dá)的hacat表皮細(xì)胞模型,然后運(yùn)用wb法檢測(cè)cd9調(diào)控后的hacat表皮細(xì)胞中整合素亞基的表達(dá)變化。同時(shí)提取hacat表皮細(xì)胞的細(xì)胞膜蛋白使用免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)整合素亞基間的結(jié)合變化。免疫熒光染色及流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)均被用來檢測(cè)表皮細(xì)胞膜上整合素αvβ5及αvβ6的分布變化。另外,整合素功能阻斷劑10d5和p1f6(10μg/ml)也被分別用來觀察整合素αvβ5或αvβ6在cd9介導(dǎo)的表皮細(xì)胞mmp-9激活及遷移中的作用。3.hacat表皮細(xì)胞及原代小鼠皮膚表皮細(xì)胞(mks)進(jìn)行高鈣處理(1.2mm)24h建立表皮細(xì)胞分化模型,然后使用wb法檢測(cè)cd9的表達(dá)變化。使用活細(xì)胞工作站動(dòng)態(tài)拍攝技術(shù)觀察單個(gè)表皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性,并使用imagej軟件進(jìn)行分析;cd9高表達(dá)或干擾表達(dá)mks分別于低鈣或高鈣條件下培養(yǎng)24h,觀察cd9對(duì)表皮細(xì)胞直徑及鋪展面積的影響,同時(shí)使用wb法檢測(cè)分化標(biāo)記物(ck1,ck10,loricrin和filaggrin)的表達(dá)變化。免疫熒光染色被用來觀察e-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞間粘附,而wb法及ip技術(shù)被用來檢測(cè)cd9調(diào)控的表皮細(xì)胞中pi3k信號(hào)通路激活情況。使用e-cadherinsirna或ly294002處理低鈣條件培養(yǎng)的cd9高表達(dá)表皮細(xì)胞,以觀察其對(duì)cd9調(diào)控的表皮細(xì)胞分化及運(yùn)動(dòng)性的影響。使用jnk信號(hào)通路抑制劑sp600125處理cd9干擾表達(dá)的表皮細(xì)胞以檢測(cè)jnk信號(hào)通路在e-cadherin向細(xì)胞膜上募集中的作用。此外,ihc法觀察ck10及e-cadherin在cd9基因敲除的小鼠皮膚表皮細(xì)胞膜上表達(dá)變化。4.hacat表皮細(xì)胞及原代小鼠皮膚表皮細(xì)胞(mks)進(jìn)行缺氧處理(2%o2)12h、24h及36h,然后使用wb及real-timepcr技術(shù)檢測(cè)cd9水平變化。重組腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)制作cd9高表達(dá)或干擾表達(dá)的hacat表皮細(xì)胞模型再進(jìn)行缺氧處理,然后使用劃痕法及活細(xì)胞工作站動(dòng)態(tài)攝像技術(shù)觀察cd9對(duì)缺氧hacat細(xì)胞的作用。wb法檢測(cè)p38/mapk信號(hào)通路激活情況并使用sb203580或mkk6(glu)轉(zhuǎn)染調(diào)節(jié)缺氧表皮細(xì)胞中p38/mapk信號(hào)通路后,wb法檢測(cè)cd9表達(dá)變化。同時(shí)使用細(xì)胞劃痕分析及細(xì)胞遷移分析法檢測(cè)p38/mapk信號(hào)通路在cd9調(diào)節(jié)的缺氧表皮細(xì)胞遷移中的作用。結(jié)果1.在體或離體創(chuàng)面愈合模型中創(chuàng)緣移行表皮細(xì)胞中cd9的表達(dá)均下調(diào),且cd9的下調(diào)表達(dá)可促進(jìn)表皮細(xì)胞移行,而cd9的高表達(dá)作用則相反。cd9可負(fù)向調(diào)控表皮細(xì)胞中mmp-9的活性及蛋白水平。cd9低表達(dá)激活的jnk信號(hào)通路也參與上調(diào)表皮細(xì)胞中mmp-9的活性及表達(dá),而sp600125抑制jnk信號(hào)通路后卻可使cd9干擾的表皮細(xì)胞中mmp-9活性及蛋白水平下調(diào)。2.cd9可調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞中β5和β6的表達(dá),且cd9干擾后可促進(jìn)表皮細(xì)胞中αvβ5向αvβ6的轉(zhuǎn)換,而cd9高表達(dá)卻可逆轉(zhuǎn)這一轉(zhuǎn)換過程。使用10d5對(duì)整合素αvβ6進(jìn)行功能阻斷后可顯著抑制cd9下調(diào)誘導(dǎo)的表皮細(xì)胞遷移及mmp-9激活。3.分化的表皮細(xì)胞中cd9的表達(dá)明顯提高;且cd9高表達(dá)可促進(jìn)表皮細(xì)胞分化并抑制其運(yùn)動(dòng)性;而cd9干擾后可抑制高鈣誘導(dǎo)的表皮細(xì)胞分化過程并提高細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性。cd9上調(diào)后可促進(jìn)e-cadherin向細(xì)胞膜上募集并激活下游pi3k信號(hào)通路,而cd9干擾后可抑制這一過程。另外,e-cadherin干擾后或pi3k信號(hào)通路受抑后均可逆轉(zhuǎn)cd9上調(diào)誘導(dǎo)的表皮細(xì)胞分化及運(yùn)動(dòng)性下降。4.缺氧可下調(diào)cd9在表皮細(xì)胞中的表達(dá)水平并促進(jìn)細(xì)胞遷移;而cd9高表達(dá)可抑制缺氧促進(jìn)的表皮細(xì)胞遷移作用。缺氧還可激活p38/mapk信號(hào)通路;使用sb203580可上調(diào)表皮細(xì)胞中cd9的蛋白水平并下調(diào)缺氧條件下表皮細(xì)胞的遷移速率;而使用mkk6(glu)腺病毒轉(zhuǎn)染促進(jìn)p38/mapk信號(hào)通路激活后,卻可使cd9表達(dá)下調(diào)并促進(jìn)缺氧條件下表皮細(xì)胞的遷移。結(jié)論1.cd9在體內(nèi)及體外創(chuàng)面愈合模型的移行表皮細(xì)胞中均呈下調(diào)表達(dá),且cd9的低表達(dá)可促進(jìn)表皮細(xì)胞的遷移,mmp-9參與了cd9介導(dǎo)的表皮細(xì)胞遷移調(diào)控,激活jnk通路可使mmp-9活化,顯著促進(jìn)cd9介導(dǎo)的表皮細(xì)胞遷移。2.下調(diào)cd9表達(dá)可促進(jìn)皮膚表皮細(xì)胞中整合素ανβ5向ανβ6的轉(zhuǎn)化,而整合素αvβ5和αvβ6間的轉(zhuǎn)換在cd9介導(dǎo)的表皮細(xì)胞遷移及mmp-9激活調(diào)節(jié)過程中均起重要作用。3.CD9可調(diào)控表皮細(xì)胞分化狀態(tài)及運(yùn)動(dòng)性間的平衡,且其介導(dǎo)的E-cadherin向細(xì)胞膜上的募集及下游PI3K信號(hào)的激活在這一過程中起重要調(diào)節(jié)作用。4.缺氧可明顯下調(diào)表皮細(xì)胞中CD9的表達(dá)而促進(jìn)表皮細(xì)胞遷移,p38通路在CD9介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的表皮細(xì)胞遷移調(diào)控中起重要作用。本研究深化了對(duì)CD9在創(chuàng)面愈合中作用的認(rèn)識(shí),也為揭示創(chuàng)面愈合規(guī)律提供了新的視角,并為創(chuàng)面愈合的臨床治療提供了新的可能的分子靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R641

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;KAI1/CD82 suppresses hepatocyte growth factorinduced migration of hepatoma cells via upregulationof Sprouty2[J];Science in China(Series C:Life Sciences);2008年07期

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本文編號(hào)：1603968