本文選題：創(chuàng)傷性腦損傷　切入點(diǎn)：載脂蛋白E　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分載脂蛋白E對(duì)神經(jīng)元機(jī)械損傷后軸突再生修復(fù)的作用及機(jī)制研究目的:創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)是神經(jīng)外科的常見(jiàn)病之一,具有致死致殘率高、預(yù)后不良的特點(diǎn),如何改善其預(yù)后仍是目前治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)。神經(jīng)傳導(dǎo)通路的修復(fù)直接影響TBI的預(yù)后,其中軸突再生是神經(jīng)修復(fù)的中心環(huán)節(jié)。載脂蛋白E(Apolipoprotein E,Apo E)是神經(jīng)系統(tǒng)最主要的載脂蛋白,已經(jīng)證實(shí)能夠改善TBI預(yù)后。本課題研究Apo E蛋白對(duì)TBI后神經(jīng)元軸突再生修復(fù)的影響及機(jī)制,探討其作為TBI治療靶點(diǎn)的可能性。方法:1.培養(yǎng)APOE基因野生鼠和APOE基因敲除鼠的原代皮層神經(jīng)元,利用移液器槍頭劃傷神經(jīng)元的方法構(gòu)建神經(jīng)元機(jī)械損傷模型離體模擬TBI后的神經(jīng)元損傷。1)將細(xì)胞分為APOE野生鼠組和APOE敲除鼠組,在損傷后24h,對(duì)神經(jīng)元的新生軸突進(jìn)行免疫熒光染色,觀察傷后24h軸突再生的總長(zhǎng)度;2)Western blot檢測(cè)損傷后24h細(xì)胞內(nèi)的銜接蛋白(Disabled-1,Dab1)磷酸化、軸突生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(Growth associated protein 43,GAP43)的表達(dá)水平。2.構(gòu)建沉默野生鼠神經(jīng)元Dab1蛋白的Dab1 si RNA慢病毒載體(LV/Dab1 si RNA)。將神經(jīng)元隨機(jī)分為空載病毒組、LV/Dab1 si RNA-1、LV/Dab1 si RNA-2和LV/Dab1 si RNA-3組,在轉(zhuǎn)染后72h,western blot檢測(cè)各組Dab1蛋白的表達(dá)水平,篩選沉默效率最高的LV/Dab1 si RNA。3.通過(guò)LV/Dab1 si RNA沉默野生鼠神經(jīng)元Dab1基因并構(gòu)建神經(jīng)元機(jī)械損傷模型。將神經(jīng)元分為以下4組:(1)陰性對(duì)照組:陰性對(duì)照病毒感染神經(jīng)元,沒(méi)有給予機(jī)械損傷,同一時(shí)間點(diǎn)給予血清白蛋白(10μg/ml)作為對(duì)照;(2)陽(yáng)性對(duì)照組:陰性對(duì)照病毒感染神經(jīng)元,給予機(jī)械損傷,傷后給予等劑量的血清白蛋白;(3)Apo E蛋白治療組:陰性對(duì)照病毒感染神經(jīng)元,同樣給予機(jī)械損傷,在傷后給予外源性重組Apo E蛋白(10μg/ml);(4)Apo E+LV/Dab1 si RNA組:LV/Dab1si RNA感染神經(jīng)元,同樣給予機(jī)械損傷,在傷后給予等劑量的Apo E蛋白。1)免疫熒光染色并觀察各組傷后24h的再生軸突總長(zhǎng)度、新生生長(zhǎng)錐的數(shù)量和面積;2)Western blot檢測(cè)損傷后24h各組細(xì)胞內(nèi)的Dab1磷酸化、細(xì)胞分裂周期蛋白42(Cell division control protein 42,CDC42)活性以及GAP43蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:1.在神經(jīng)元損傷后24h,APOE野生鼠組的軸突再生總長(zhǎng)度顯著高于APOE基因敲除鼠組;此時(shí),APOE野生鼠組的Dab1磷酸化水平顯著高于APOE基因敲除鼠組;APOE野生鼠組的GAP43表達(dá)水平也顯著高于敲除鼠組。2.LV/Dab1 si RNA-1,LV/Dab1 si RNA-2和LV/Dab1 si RNA-3組的Dab1蛋白表達(dá)明顯低于空載病毒組;LV/Dab1 si RNA-2組的Dab1蛋白表達(dá)水平最低。3.在神經(jīng)元損傷后24h,Apo E蛋白治療組的軸突再生長(zhǎng)度、新生生長(zhǎng)錐的數(shù)量和面積均明顯高于沒(méi)有給予Apo E蛋白的陽(yáng)性對(duì)照組。4.在軸突再生修復(fù)的過(guò)程中,Apo E蛋白治療組和陽(yáng)性對(duì)照組的Dab1磷酸化、Cdc42活性和GAP43表達(dá)水平均顯著高于沒(méi)有神經(jīng)元軸突再生修復(fù)的陰性對(duì)照組;同時(shí),Apo E蛋白治療組的Dab1磷酸化、Cdc42活性和GAP43表達(dá)水平均顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組。5.在神經(jīng)元損傷后24h,Dab1被沉默的Apo E+LV/Dab1 si RNA組的軸突再生長(zhǎng)度、新生生長(zhǎng)錐的數(shù)量和面積明顯低于正常表達(dá)Dab1的Apo E蛋白治療組;Apo E+LV/Dab1 si RNA組的Cdc42活性和GAP43表達(dá)水平也顯著低于Apo E蛋白治療組。結(jié)論:皮層神經(jīng)元機(jī)械損傷后因?yàn)槿狈po E蛋白導(dǎo)致軸突再生修復(fù)受到抑制;而給予Apo E蛋白能夠促進(jìn)神經(jīng)元的軸突再生修復(fù)。Apo E蛋白可能通過(guò)上調(diào)Dab1磷酸化,激活Cdc42活性,從而促進(jìn)軸突再生修復(fù),最終改善TBI的預(yù)后。第二部分載脂蛋白J對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究目的:創(chuàng)傷性腦損傷的繼發(fā)性病理生理?yè)p害包括氧化應(yīng)激、炎癥激活、血腦屏障破壞等,是影響病情的主要因素,但目前仍缺乏有效的干預(yù)手段。載脂蛋白J(Apolipoprotein J,Apo J)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的載脂蛋白,已經(jīng)證實(shí)在神經(jīng)免疫和神經(jīng)修復(fù)方面具有重要作用。本研究探討Apo J蛋白對(duì)TBI的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制,為TBI治療提供潛在的有效治療靶點(diǎn)。方法:1.在C57BL/6J小鼠建立控制性皮層撞擊損傷模型(Controlled cortex impact,CCI)在體模擬TBI。Western blot檢測(cè)Apo J蛋白在傷前、傷后6h,1d,3d,5d,7d,10d,14d,28d的表達(dá)變化。2.將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、對(duì)照組和Apo J組。假手術(shù)組和對(duì)照組傷前給予100μl 5μg/m L血清白蛋白(BSA),Apo J組傷前側(cè)腦室注射100μl 5μg/m L人重組Apo J蛋白。利用神經(jīng)損傷評(píng)分(NSS評(píng)分)和水迷宮實(shí)驗(yàn)分別評(píng)估傷后小鼠的運(yùn)動(dòng)功能和認(rèn)知功能的恢復(fù)情況。3.將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、對(duì)照組和Apo J組,處理同上。在傷后24h,利用western blot檢測(cè)傷灶周圍腦組織的氧化應(yīng)激標(biāo)志物3-NT和4-HNE,補(bǔ)體反應(yīng)產(chǎn)物C3b和C5b-9的表達(dá)水平;在傷后24h,利用PCR檢測(cè)傷灶周圍腦組織炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平;在傷后24h,組織免疫熒光檢測(cè)傷灶周圍的星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活反應(yīng);在傷后7天,組織免疫熒光檢測(cè)傷側(cè)皮層和海馬存活神經(jīng)元的數(shù)量;在傷后24h,伊文思藍(lán)染色檢測(cè)雙側(cè)大腦半球的血腦屏障通透性,以及利用干濕重法檢測(cè)雙側(cè)大腦半球的腦含水量。結(jié)果:1.Apo J蛋白在CCI傷后表達(dá)明顯升高,在傷后6h表達(dá)最高,然后逐漸下降,傷后7天回到基值。2.NSS評(píng)分結(jié)果顯示Apo J組的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)顯著優(yōu)于對(duì)照組;兩組的水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有顯著差異。3.傷后24h,CCI組(即對(duì)照組和Apo J組)的氧化應(yīng)激標(biāo)志物3-NT和4-HNE顯著高于假手術(shù)組,其中Apo J組的3-NT和4-HNE顯著低于對(duì)照組;CCI組的補(bǔ)體激活產(chǎn)物C3b和C5b-9顯著高于假手術(shù)組,其中Apo J組的補(bǔ)體途徑終產(chǎn)物C5b-9顯著低于對(duì)照組,但是Apo J組的C3b與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異。4.傷后24h,CCI組IL-1β,IL-6和TNF-αm RNA水平顯著高于假手術(shù)組,其中Apo J組的IL-1β和TNF-α顯著低于對(duì)照組,但是IL-6與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異。5.傷后24h,CCI組的星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活數(shù)量顯著高于假手術(shù)組,Apo J組的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活數(shù)量顯著低于對(duì)照組;傷后7天,CCI組的皮層及海馬神經(jīng)元存活數(shù)量明顯低于假手術(shù)組,其中Apo J組的皮層及海馬區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)量顯著高于對(duì)照組。6.傷后24h,CCI組的傷側(cè)大腦半球血腦屏障通透性明顯高于假手術(shù)組,其中Apo J組的血腦屏障通透性顯著低于對(duì)照組;CCI組傷側(cè)大腦半球含水量也明顯高于假手術(shù)組,其中Apo J組的傷側(cè)大腦半球含水量顯著低于對(duì)照組。結(jié)論:Apo J蛋白可以改善小鼠TBI后的神經(jīng)功能恢復(fù)。Apo J蛋白可能通過(guò)抗氧化應(yīng)激、抑制神經(jīng)炎癥、降低腦水腫、保護(hù)神經(jīng)元等綜合作用促進(jìn)TBI的神經(jīng)功能修復(fù),提示Apo J蛋白可能是TBI的一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R651.15

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本文編號(hào)：1591193