發(fā)布時(shí)間：2018-02-23 18:41

  本文關(guān)鍵詞： 非肌肉球蛋白Ⅱ 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 吸入性損傷 凋亡　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景吸入性損傷在人類城市發(fā)展史中曾造成巨大的災(zāi)難,1942年美國(guó)波士頓椰樹林夜總會(huì)火災(zāi),密閉空間起火后患者吸入大量未燃燼的煙霧、炭粒、有刺激性的化學(xué)物質(zhì)等,雖經(jīng)搶救,但是大量死亡,共造成造成492人死亡,成為美國(guó)傷亡最為慘重的火災(zāi)事故,主要就是吸入性損傷所致。上海2010年11月15日,靜安區(qū)膠州路重大火災(zāi),上海市醫(yī)療機(jī)構(gòu)共救治傷員127人,其中死亡41人,收治住院治療71人,死亡和住院的大部分人都有吸入性損傷,其發(fā)病率和病死率非常高。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)是一類具備自我更新和分化潛能的多能干細(xì)胞,取材簡(jiǎn)便,不會(huì)發(fā)生免疫排斥反應(yīng),具有重要的免疫調(diào)節(jié)和抗炎活性,研究發(fā)現(xiàn)其能夠向多種組織誘導(dǎo)分化,如骨、軟骨等,同時(shí)具備較強(qiáng)的內(nèi)分泌能力和免疫調(diào)節(jié)功能,是理想的組織修復(fù)來源,近年研究證實(shí),BMSC移植能改善急性肺損傷(ALI)肺內(nèi)及全身的炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)ALI體內(nèi)免疫紊亂,“歸巢”至肺損傷區(qū)域,向肺內(nèi)功能細(xì)胞分化并發(fā)揮相應(yīng)功能,參與受損肺組織的修復(fù),因而被認(rèn)為是急性肺損傷治療中極具前景的治療措施。雖然BMSC移植治療ALI有很好的效果,但是在體內(nèi)的移植率和存活率受多因素影響,壞死或凋亡是最主要形式,因此,提高或者改善BMSC移植后在體內(nèi)的移植率和存活率是這種治療方法得到廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵所在,越來越多的研究者提出了多種學(xué)說,探索了多種方法以期能夠提高移植BMSC的移植率和存活率。肌球蛋白是一種球蛋白,是肌肉的主要組成分子,主要為肌肉收縮提供力,它具有酶的活性,可以通過與肌動(dòng)蛋白相互作用,水解ATP的末端磷酸基團(tuán)和GTP、CTP等,將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能。肌球蛋白也廣泛存在于非肌肉組織中稱為非肌肉球蛋白,非肌肉肌球蛋白Ⅱ(non-muscle myosinⅡ,NMⅡ)是非肌球蛋白家族中的一種,文獻(xiàn)報(bào)道它是多種疾病的關(guān)鍵分子,參與了細(xì)胞的各種生理活動(dòng),特別是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面,它是細(xì)胞正常生理活動(dòng)的一種關(guān)鍵蛋白分子,具有很重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用,因此具有很高的研究?jī)r(jià)值。鑒于此,我們選取NMⅡ?yàn)檠芯繉?duì)象,并經(jīng)過前期研究發(fā)現(xiàn),下調(diào)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中非肌肉球蛋白NMⅡ,再移植到煙霧急性肺損傷的模型上,通過比較發(fā)現(xiàn)其效果比單純無修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植效果更好。通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),調(diào)控NMⅡ基因可以使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在移植凋亡、減輕炎癥反應(yīng)等方面比未調(diào)控NMⅡ基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更為明顯。通過一系列實(shí)驗(yàn)后我們發(fā)現(xiàn),下調(diào)NMⅡ基因表達(dá)能夠抑制干細(xì)胞凋亡,促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢至損傷部位,降低損傷部位炎癥反應(yīng),比傳統(tǒng)的單純使用間充質(zhì)干細(xì)胞更為有效,尤其對(duì)毛細(xì)血管豐富的肺部損傷更加有效。對(duì)NMⅡ基因進(jìn)一步深入研究,可以為干細(xì)胞治療煙霧吸入性損傷以及ALI/ARDS引入新的研究靶點(diǎn)并向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。第一部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的制備及鑒定研究目的:根據(jù)課題研究的目的,制備骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行鑒定,為后續(xù)研究NMⅡ基因調(diào)控治療吸入性損傷模型的療效和保護(hù)機(jī)制提供載體。研究方法:大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)過程如下:選取周齡4周,體重160g-200g左右的雄性大鼠,分離大鼠的股骨和脛骨獲取骨髓,200目濾網(wǎng)過濾至細(xì)胞培養(yǎng)皿中,在37°C溫度下5%CO_2培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)2-3代后進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定、表面抗原鑒定、分化潛能的鑒定。研究結(jié)果:顯微鏡下觀察到貼壁細(xì)胞的形態(tài)大小不一,形態(tài)各樣,大部分成梭形生長(zhǎng),形態(tài)類似成纖維細(xì)胞;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型鑒定為符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原;細(xì)胞經(jīng)過成脂成骨誘導(dǎo)后為陽性。研究結(jié)論:經(jīng)過鑒定,所獲取的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。第二部分干擾NMⅡ表達(dá)的載體構(gòu)建和細(xì)胞株的篩選研究目的:制備NMⅡ表達(dá)降低的細(xì)胞株,為后續(xù)治療提供細(xì)胞。研究方法:通過干擾序列的設(shè)計(jì)和重組載體的構(gòu)建,轉(zhuǎn)染前面已鑒定的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中,然后進(jìn)行鑒定。研究結(jié)果:得到重組后的PLL載體,轉(zhuǎn)染至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中,得到了NMⅡ表達(dá)降低的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞研究結(jié)論:經(jīng)過鑒定,轉(zhuǎn)染重組載體的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞NMⅡ表達(dá)降低。第三部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞NMⅡ基因調(diào)控對(duì)吸入性損傷療效及機(jī)制研究研究目的:檢測(cè)NMⅡ基因調(diào)控的骨髓間充干細(xì)胞對(duì)吸入性損傷模型的治療效果并探討其機(jī)制研究方法:首先建立煙霧吸入性肺損傷模型;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行分組為對(duì)照組,損傷組,BMSC治療組,BMSC-Sh RNA治療組四組;分別采集大鼠動(dòng)脈血進(jìn)行血?dú)夥治?使用探針CM-Di I標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞在大鼠體內(nèi)的分布情況;大鼠支氣管肺泡灌洗液的收集;大鼠肺臟的干濕比測(cè)定;HE檢測(cè)24h肺部的炎癥反應(yīng)情況;ELISA檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中TNF-α和IL-10因子;NMⅡ基因沉默對(duì)BMSC細(xì)胞凋亡的影響;NMⅡ基因沉默對(duì)BMSC細(xì)胞旁分泌系統(tǒng)的影響。研究結(jié)果:干細(xì)胞移植后的24h時(shí)間點(diǎn)取血進(jìn)行血?dú)夥治霭l(fā)現(xiàn),損傷組大鼠出現(xiàn)明顯的低氧血癥、二氧化碳潴留和酸中毒癥狀;而治療組與損傷組比較差異具有顯著性,可推斷BMSCs移植后對(duì)肺損傷有治療作用。使用CD-Di I標(biāo)記的轉(zhuǎn)染NMⅡ-Sh RNA的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,尾靜脈注射吸入性損傷模型,1、4、7天取大鼠肺臟,染色,熒光顯微鏡下觀察到BMSCs細(xì)胞的歸巢。HE染色發(fā)現(xiàn)干擾組的損傷情況明顯減輕。肺泡灌洗液(BALF)El ISA法檢測(cè)肺泡灌洗液中TNF-a降低和IL-10的濃度升高。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的干擾組比為干擾組的caspase-3表達(dá)明顯降低。NMⅡ基因沉默對(duì)BMSC細(xì)胞旁分泌系統(tǒng)HGF的VEGF都比正常組升高。研究結(jié)論:下調(diào)NMⅡ基因表達(dá)能夠抑制干細(xì)胞凋亡,促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢至損傷部位,降低損傷部位炎癥反應(yīng),比傳統(tǒng)的單純使用間充質(zhì)干細(xì)胞更為有效。
[Abstract]:Bone marrow mesenchymal stem cell ( BMSC ) is a kind of multipotent stem cells with self - renewal and differentiation potential . In this paper , we find that the regulation of NM - 鈪，

本文編號(hào)：1527210