本文關(guān)鍵詞： 脈沖直流電 持續(xù)直流電 電趨性 場(chǎng)強(qiáng) 脈寬 頻率 表皮細(xì)胞 電化學(xué)反應(yīng)　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景自19世紀(jì)發(fā)現(xiàn)人體生理電場(chǎng)以來,從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)到在體實(shí)驗(yàn),人們對(duì)電場(chǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞遷移、促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用進(jìn)行了大量研究。研究發(fā)現(xiàn),正常皮膚表皮或上皮組織細(xì)胞間能夠維持定向的離子流動(dòng),從而形成縱向電位差;當(dāng)皮膚或上皮組織的完整性受到破壞、形成創(chuàng)面時(shí),該電位差在創(chuàng)面處迅速短路,使電流從正常組織區(qū)域流向創(chuàng)面,形成電場(chǎng)方向指向創(chuàng)面的橫向電場(chǎng),這即是創(chuàng)面內(nèi)源性電場(chǎng)。近年研究顯示,創(chuàng)面內(nèi)源性電場(chǎng)是指導(dǎo)表皮細(xì)胞定向遷移的關(guān)鍵因素,而后者是創(chuàng)面愈合的前題基礎(chǔ)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),表皮細(xì)胞能在外加持續(xù)直流電場(chǎng)下產(chǎn)生定向遷移,該現(xiàn)象稱為表皮細(xì)胞的電趨性。目前,國(guó)內(nèi)外多數(shù)研究均采用持續(xù)直流電場(chǎng)作為刺激因素研究細(xì)胞的電趨性及其機(jī)制。然而,持續(xù)直流電場(chǎng)長(zhǎng)時(shí)間作用將不可避免導(dǎo)致熱效應(yīng)和電解效應(yīng)等電刺激副作用,使得持續(xù)直流電場(chǎng)的在體應(yīng)用受到限制、現(xiàn)有研究與臨床應(yīng)用脫軌。我們前期發(fā)現(xiàn),處于持續(xù)直流電場(chǎng)環(huán)境中的成纖維細(xì)胞去掉電場(chǎng)作用后,其電趨性并不會(huì)立即消失,而在一定時(shí)間內(nèi)仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的定向遷移特性,提示細(xì)胞的電趨性誘導(dǎo)或維持并不需要持續(xù)的電刺激,進(jìn)而我們推測(cè)脈沖直流電可能同樣具有誘導(dǎo)細(xì)胞電趨性的作用。脈沖直流電場(chǎng)(PDCEF)是一種間斷作用的直流電場(chǎng),具有場(chǎng)強(qiáng)(EF)、頻率(f)和脈寬(D)三個(gè)可變參數(shù)。與持續(xù)直流電場(chǎng)(CDCEF)相比,PDCEF能通過調(diào)節(jié)脈寬進(jìn)而調(diào)節(jié)電場(chǎng)的作用時(shí)間;若低脈寬的脈沖直流電能誘導(dǎo)細(xì)胞電趨性,那么無疑將顯著減少電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞的作用時(shí)間,減輕電場(chǎng)的熱效應(yīng)和電解效應(yīng),從而有可能為臨床應(yīng)用電場(chǎng)促進(jìn)創(chuàng)面愈合提供新的技術(shù)方法。本研究旨在探討不同參數(shù)條件下PDCEF對(duì)表皮細(xì)胞電趨性的誘導(dǎo)作用;通過與相同場(chǎng)強(qiáng)的CDCEF比較,評(píng)估PDCEF誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的效能與副作用,為臨床應(yīng)用PDCEF促進(jìn)創(chuàng)面愈合奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。材料與方法1、乳鼠原代表皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與細(xì)胞電趨性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⑷〕錾?-3天的balb/c乳鼠全層皮膚,用dispaseⅡ溶液4°c孵育過夜;次日分離表皮,將其剪碎后用0.25%胰酶消化約5min,血清終止消化,反復(fù)吹打后過濾、離心;調(diào)整細(xì)胞密度至1x103后將細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片,置于37°c、5%co2孵箱中培養(yǎng)待用。將構(gòu)建的電趨性小室模型浸泡于75%的酒精中30min,然后置于超凈臺(tái)紫外燈下照射30min。將接種有表皮細(xì)胞的細(xì)胞爬片置入電趨性小室,在電趨性小室兩側(cè)加細(xì)胞培養(yǎng)基各2ml,使電趨性小室中充滿培養(yǎng)基;常規(guī)構(gòu)筑外加電場(chǎng)裝置,將構(gòu)建好的細(xì)胞電趨性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭糜诨罴?xì)胞工作站,實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞在電場(chǎng)作用下的遷移運(yùn)動(dòng)。2、脈沖直流電場(chǎng)誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的作用和特性分析1)選取一定參數(shù)的pdcef(ef=150mv/mm,d=60%,f=0.1hz)作用表皮細(xì)胞3h,imagej軟件分析表皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的方向性和速度,明確pdcef是否具有表皮細(xì)胞電趨性誘導(dǎo)作用。2)固定pdcef頻率為0.1hz、脈寬為60%,觀察場(chǎng)強(qiáng)變化(0-200mv/mm)對(duì)表皮細(xì)胞電趨性的影響。3)固定pdcef頻率為0.1hz、場(chǎng)強(qiáng)為150mv/mm,觀察脈寬變化(0-100%)對(duì)表皮細(xì)胞電趨性的影響。由于脈寬為100%的pdcef實(shí)質(zhì)上為cdcef,因此上述實(shí)驗(yàn)可用于對(duì)比分析相同場(chǎng)強(qiáng)作用條件下pdcef和cdcef誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的差異。4)固定pdcef場(chǎng)強(qiáng)為150mv/mm、脈寬為60%,觀察頻率(0.001-5000000hz)變化對(duì)細(xì)胞電趨性的影響。3、脈沖和持續(xù)直流電場(chǎng)誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性和介導(dǎo)電化學(xué)副反應(yīng)的對(duì)比研究1)在場(chǎng)強(qiáng)(50-250mv/mm)相同的條件下,對(duì)比分析不同脈寬(20-80%)的pdcef(頻率為0.1hz)和cdcef(脈寬為100%的pdcef)誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的差異。2)分析在場(chǎng)強(qiáng)(50-250mv/mm)相同的條件下,當(dāng)不同脈寬(40-80%)的pdcef(頻率為0.1hz)實(shí)際作用于細(xì)胞的電刺激時(shí)間與cdcef相同時(shí)表皮細(xì)胞電趨性差異。3)在相同場(chǎng)強(qiáng)(ef=150mv/mm)作用條件下,對(duì)比分析pdcef和cdcef對(duì)電趨性模型中溶液或細(xì)胞培養(yǎng)基ph值和mv值變化的影響,明確pdcef和cdcef介導(dǎo)電化學(xué)副反應(yīng)差異。結(jié)果1、乳鼠原代表皮細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞電趨性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒃∈蟊砥ぜ?xì)胞接種培養(yǎng)4h左右開始貼壁、伸展,細(xì)胞輪廓清晰,呈圓形或橢圓形,可見偽足伸展,折光性好,生長(zhǎng)旺盛。構(gòu)建的電趨性實(shí)驗(yàn)裝置可用于活細(xì)胞工作站下實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng);電場(chǎng)持續(xù)作用3h,電趨性小室兩側(cè)電壓波動(dòng)小,表明實(shí)驗(yàn)裝置具有良好的穩(wěn)定性。2、脈沖直流電場(chǎng)誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的特性分析1)在3h的觀察時(shí)間內(nèi),無電場(chǎng)作用的表皮細(xì)胞呈現(xiàn)隨機(jī)運(yùn)動(dòng)(方向性:-0.09±0.05);而pdcef(ef=150mv/mm,d=60%,f=0.1hz)作用的表皮細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的向電場(chǎng)陰極遷移運(yùn)動(dòng)(方向性:0.76±0.04),同時(shí)在x軸方向上的運(yùn)動(dòng)速度顯著增高。時(shí)效分析顯示,施加pdcef30分鐘內(nèi),表皮細(xì)胞即表現(xiàn)出向電場(chǎng)陰極定向遷移的特性,且運(yùn)動(dòng)速度增加。2)在固定頻率(0.1hz)和脈寬(60%)的條件下,pdcef誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的特性與場(chǎng)強(qiáng)呈正相關(guān);場(chǎng)強(qiáng)越高,表皮細(xì)胞的電趨性越好,表現(xiàn)為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的方向性和速度增加。場(chǎng)強(qiáng)為50mv/mm時(shí),表皮細(xì)胞向電場(chǎng)陰極遷移的方向性為0.35±0.05,提示該條件下pdcef誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的閾值電壓在50mv/mm以下。3)在固定頻率(0.1hz)和場(chǎng)強(qiáng)(150mv/mm)的條件下,pdcef誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的特性與脈寬呈正相關(guān);脈寬越大,表皮細(xì)胞的電趨性越好。脈寬為20%時(shí),表皮細(xì)胞向電場(chǎng)陰極遷移的方向性為0.26±0.05,提示該條件下pdcef誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的閾值脈寬為20%左右。當(dāng)脈寬達(dá)到或大于60%時(shí),表皮細(xì)胞向陰極遷移的方向性增加不再顯著,與100%的脈寬(實(shí)質(zhì)為持續(xù)直流電場(chǎng))比較無顯著差異。4)在固定場(chǎng)強(qiáng)(150mv/mm)和脈寬(60%)的條件下,0.001-1000hz之內(nèi)的頻率變化對(duì)pdcef誘導(dǎo)的表皮細(xì)胞電趨性無顯著影響;當(dāng)頻率達(dá)到5000000hz時(shí),表皮細(xì)胞的電趨性顯著下降。3、脈沖和持續(xù)直流電場(chǎng)誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性和電化學(xué)副反應(yīng)的對(duì)比研究1)在場(chǎng)強(qiáng)相同的條件下,達(dá)到一定閾值脈寬的pdcef(頻率為0.1hz)均能誘導(dǎo)與cdcef等效的電趨性。場(chǎng)強(qiáng)為50mv/mm時(shí),pdcef達(dá)到與cdcef等效電趨性的閾值脈寬為80%;場(chǎng)強(qiáng)為150mv/mm時(shí),pdcef達(dá)到與cdcef等效電趨性的閾值脈寬為60%;場(chǎng)強(qiáng)為250mv/mm時(shí),pdcef達(dá)到與cdcef等效電趨性的閾值脈寬為40%。2)在場(chǎng)強(qiáng)相同的條件下,當(dāng)PDCEF(頻率為0.1Hz)實(shí)際作用于細(xì)胞的電刺激時(shí)間與CDCEF相同時(shí),PDCEF較之CDCEF能以更短的實(shí)際電刺激時(shí)間誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性。場(chǎng)強(qiáng)為50、150和250mV/mm時(shí),PDCEF誘導(dǎo)表皮細(xì)胞出現(xiàn)電趨性的時(shí)間分別為30min、15min和15min;而CDCEF誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性出現(xiàn)的時(shí)間分別為45min,45min和30min,提示間斷電刺激能增強(qiáng)表皮細(xì)胞的電趨性反應(yīng)。3)在場(chǎng)強(qiáng)相同的條件下,PDCEF所導(dǎo)致的細(xì)胞培養(yǎng)基或緩沖液p H和m V值改變顯著小于CDCEF,且隨時(shí)間的增加,這一趨勢(shì)越明顯。結(jié)論1、PDCEF具有誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的重要作用,其電趨性誘導(dǎo)效應(yīng)呈場(chǎng)強(qiáng)、作用時(shí)間、脈寬和頻率依賴性。2、在場(chǎng)強(qiáng)相同的條件下,達(dá)到或超過閾值脈寬的PDCEF具有與CDCEF等效的電趨性誘導(dǎo)作用,且場(chǎng)強(qiáng)越大,所需的閾值脈寬越低。3、在實(shí)際電場(chǎng)作用時(shí)間與CDCEF相同的條件下,PDCEF能在一定程度上增強(qiáng)表皮細(xì)胞的電趨性反應(yīng)。4、PDCEF對(duì)電趨性實(shí)驗(yàn)裝置中細(xì)胞培養(yǎng)基或緩沖液的電化學(xué)副反應(yīng)顯著低于CDCEF。5、較之CDCEF,適當(dāng)參數(shù)的PDCEF更適合作為新的電刺激技術(shù)用于臨床促進(jìn)創(chuàng)面愈合。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R641

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1 任淅;脈沖直流電場(chǎng)誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的作用研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：1522292