本文關(guān)鍵詞： 脈沖直流電 持續(xù)直流電 電趨性 場強 脈寬 頻率 表皮細胞 電化學(xué)反應(yīng)　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景自19世紀發(fā)現(xiàn)人體生理電場以來,從細胞實驗到在體實驗,人們對電場誘導(dǎo)細胞遷移、促進創(chuàng)面愈合的作用進行了大量研究。研究發(fā)現(xiàn),正常皮膚表皮或上皮組織細胞間能夠維持定向的離子流動,從而形成縱向電位差;當皮膚或上皮組織的完整性受到破壞、形成創(chuàng)面時,該電位差在創(chuàng)面處迅速短路,使電流從正常組織區(qū)域流向創(chuàng)面,形成電場方向指向創(chuàng)面的橫向電場,這即是創(chuàng)面內(nèi)源性電場。近年研究顯示,創(chuàng)面內(nèi)源性電場是指導(dǎo)表皮細胞定向遷移的關(guān)鍵因素,而后者是創(chuàng)面愈合的前題基礎(chǔ)。體外實驗發(fā)現(xiàn),表皮細胞能在外加持續(xù)直流電場下產(chǎn)生定向遷移,該現(xiàn)象稱為表皮細胞的電趨性。目前,國內(nèi)外多數(shù)研究均采用持續(xù)直流電場作為刺激因素研究細胞的電趨性及其機制。然而,持續(xù)直流電場長時間作用將不可避免導(dǎo)致熱效應(yīng)和電解效應(yīng)等電刺激副作用,使得持續(xù)直流電場的在體應(yīng)用受到限制、現(xiàn)有研究與臨床應(yīng)用脫軌。我們前期發(fā)現(xiàn),處于持續(xù)直流電場環(huán)境中的成纖維細胞去掉電場作用后,其電趨性并不會立即消失,而在一定時間內(nèi)仍表現(xiàn)出較強的定向遷移特性,提示細胞的電趨性誘導(dǎo)或維持并不需要持續(xù)的電刺激,進而我們推測脈沖直流電可能同樣具有誘導(dǎo)細胞電趨性的作用。脈沖直流電場(PDCEF)是一種間斷作用的直流電場,具有場強(EF)、頻率(f)和脈寬(D)三個可變參數(shù)。與持續(xù)直流電場(CDCEF)相比,PDCEF能通過調(diào)節(jié)脈寬進而調(diào)節(jié)電場的作用時間;若低脈寬的脈沖直流電能誘導(dǎo)細胞電趨性,那么無疑將顯著減少電場對細胞的作用時間,減輕電場的熱效應(yīng)和電解效應(yīng),從而有可能為臨床應(yīng)用電場促進創(chuàng)面愈合提供新的技術(shù)方法。本研究旨在探討不同參數(shù)條件下PDCEF對表皮細胞電趨性的誘導(dǎo)作用;通過與相同場強的CDCEF比較,評估PDCEF誘導(dǎo)表皮細胞電趨性的效能與副作用,為臨床應(yīng)用PDCEF促進創(chuàng)面愈合奠定實驗基礎(chǔ)。材料與方法1、乳鼠原代表皮細胞的分離、培養(yǎng)與細胞電趨性實驗?zāi)Ｐ偷慕⑷〕錾?-3天的balb/c乳鼠全層皮膚,用dispaseⅡ溶液4°c孵育過夜;次日分離表皮,將其剪碎后用0.25%胰酶消化約5min,血清終止消化,反復(fù)吹打后過濾、離心;調(diào)整細胞密度至1x103后將細胞接種于細胞爬片,置于37°c、5%co2孵箱中培養(yǎng)待用。將構(gòu)建的電趨性小室模型浸泡于75%的酒精中30min,然后置于超凈臺紫外燈下照射30min。將接種有表皮細胞的細胞爬片置入電趨性小室,在電趨性小室兩側(cè)加細胞培養(yǎng)基各2ml,使電趨性小室中充滿培養(yǎng)基;常規(guī)構(gòu)筑外加電場裝置,將構(gòu)建好的細胞電趨性實驗?zāi)Ｐ椭糜诨罴毎ぷ髡?實時動態(tài)觀察細胞在電場作用下的遷移運動。2、脈沖直流電場誘導(dǎo)表皮細胞電趨性的作用和特性分析1)選取一定參數(shù)的pdcef(ef=150mv/mm,d=60%,f=0.1hz)作用表皮細胞3h,imagej軟件分析表皮細胞運動的方向性和速度,明確pdcef是否具有表皮細胞電趨性誘導(dǎo)作用。2)固定pdcef頻率為0.1hz、脈寬為60%,觀察場強變化(0-200mv/mm)對表皮細胞電趨性的影響。3)固定pdcef頻率為0.1hz、場強為150mv/mm,觀察脈寬變化(0-100%)對表皮細胞電趨性的影響。由于脈寬為100%的pdcef實質(zhì)上為cdcef,因此上述實驗可用于對比分析相同場強作用條件下pdcef和cdcef誘導(dǎo)表皮細胞電趨性的差異。4)固定pdcef場強為150mv/mm、脈寬為60%,觀察頻率(0.001-5000000hz)變化對細胞電趨性的影響。3、脈沖和持續(xù)直流電場誘導(dǎo)表皮細胞電趨性和介導(dǎo)電化學(xué)副反應(yīng)的對比研究1)在場強(50-250mv/mm)相同的條件下,對比分析不同脈寬(20-80%)的pdcef(頻率為0.1hz)和cdcef(脈寬為100%的pdcef)誘導(dǎo)表皮細胞電趨性的差異。2)分析在場強(50-250mv/mm)相同的條件下,當不同脈寬(40-80%)的pdcef(頻率為0.1hz)實際作用于細胞的電刺激時間與cdcef相同時表皮細胞電趨性差異。3)在相同場強(ef=150mv/mm)作用條件下,對比分析pdcef和cdcef對電趨性模型中溶液或細胞培養(yǎng)基ph值和mv值變化的影響,明確pdcef和cdcef介導(dǎo)電化學(xué)副反應(yīng)差異。結(jié)果1、乳鼠原代表皮細胞培養(yǎng)與細胞電趨性實驗?zāi)Ｐ徒⒃∈蟊砥ぜ毎臃N培養(yǎng)4h左右開始貼壁、伸展,細胞輪廓清晰,呈圓形或橢圓形,可見偽足伸展,折光性好,生長旺盛。構(gòu)建的電趨性實驗裝置可用于活細胞工作站下實時動態(tài)觀察細胞的遷移運動;電場持續(xù)作用3h,電趨性小室兩側(cè)電壓波動小,表明實驗裝置具有良好的穩(wěn)定性。2、脈沖直流電場誘導(dǎo)表皮細胞電趨性的特性分析1)在3h的觀察時間內(nèi),無電場作用的表皮細胞呈現(xiàn)隨機運動(方向性:-0.09±0.05);而pdcef(ef=150mv/mm,d=60%,f=0.1hz)作用的表皮細胞呈現(xiàn)明顯的向電場陰極遷移運動(方向性:0.76±0.04),同時在x軸方向上的運動速度顯著增高。時效分析顯示,施加pdcef30分鐘內(nèi),表皮細胞即表現(xiàn)出向電場陰極定向遷移的特性,且運動速度增加。2)在固定頻率(0.1hz)和脈寬(60%)的條件下,pdcef誘導(dǎo)表皮細胞電趨性的特性與場強呈正相關(guān);場強越高,表皮細胞的電趨性越好,表現(xiàn)為細胞運動的方向性和速度增加。場強為50mv/mm時,表皮細胞向電場陰極遷移的方向性為0.35±0.05,提示該條件下pdcef誘導(dǎo)表皮細胞電趨性的閾值電壓在50mv/mm以下。3)在固定頻率(0.1hz)和場強(150mv/mm)的條件下,pdcef誘導(dǎo)表皮細胞電趨性的特性與脈寬呈正相關(guān);脈寬越大,表皮細胞的電趨性越好。脈寬為20%時,表皮細胞向電場陰極遷移的方向性為0.26±0.05,提示該條件下pdcef誘導(dǎo)表皮細胞電趨性的閾值脈寬為20%左右。當脈寬達到或大于60%時,表皮細胞向陰極遷移的方向性增加不再顯著,與100%的脈寬(實質(zhì)為持續(xù)直流電場)比較無顯著差異。4)在固定場強(150mv/mm)和脈寬(60%)的條件下,0.001-1000hz之內(nèi)的頻率變化對pdcef誘導(dǎo)的表皮細胞電趨性無顯著影響;當頻率達到5000000hz時,表皮細胞的電趨性顯著下降。3、脈沖和持續(xù)直流電場誘導(dǎo)表皮細胞電趨性和電化學(xué)副反應(yīng)的對比研究1)在場強相同的條件下,達到一定閾值脈寬的pdcef(頻率為0.1hz)均能誘導(dǎo)與cdcef等效的電趨性。場強為50mv/mm時,pdcef達到與cdcef等效電趨性的閾值脈寬為80%;場強為150mv/mm時,pdcef達到與cdcef等效電趨性的閾值脈寬為60%;場強為250mv/mm時,pdcef達到與cdcef等效電趨性的閾值脈寬為40%。2)在場強相同的條件下,當PDCEF(頻率為0.1Hz)實際作用于細胞的電刺激時間與CDCEF相同時,PDCEF較之CDCEF能以更短的實際電刺激時間誘導(dǎo)表皮細胞電趨性。場強為50、150和250mV/mm時,PDCEF誘導(dǎo)表皮細胞出現(xiàn)電趨性的時間分別為30min、15min和15min;而CDCEF誘導(dǎo)表皮細胞電趨性出現(xiàn)的時間分別為45min,45min和30min,提示間斷電刺激能增強表皮細胞的電趨性反應(yīng)。3)在場強相同的條件下,PDCEF所導(dǎo)致的細胞培養(yǎng)基或緩沖液p H和m V值改變顯著小于CDCEF,且隨時間的增加,這一趨勢越明顯。結(jié)論1、PDCEF具有誘導(dǎo)表皮細胞電趨性的重要作用,其電趨性誘導(dǎo)效應(yīng)呈場強、作用時間、脈寬和頻率依賴性。2、在場強相同的條件下,達到或超過閾值脈寬的PDCEF具有與CDCEF等效的電趨性誘導(dǎo)作用,且場強越大,所需的閾值脈寬越低。3、在實際電場作用時間與CDCEF相同的條件下,PDCEF能在一定程度上增強表皮細胞的電趨性反應(yīng)。4、PDCEF對電趨性實驗裝置中細胞培養(yǎng)基或緩沖液的電化學(xué)副反應(yīng)顯著低于CDCEF。5、較之CDCEF,適當參數(shù)的PDCEF更適合作為新的電刺激技術(shù)用于臨床促進創(chuàng)面愈合。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R641

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1 任淅;脈沖直流電場誘導(dǎo)表皮細胞電趨性的作用研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

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本文編號：1522292