本文關(guān)鍵詞： 腦出血 血管性血友病因子 ADAMTS13 中性粒細(xì)胞 小膠質(zhì)細(xì)胞 組織纖溶酶原激活劑激活劑　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景：腦中風(fēng)又稱為腦卒中,是世界三大致死性和致殘性疾病之一。腦中風(fēng)分為缺血性腦中風(fēng)和出血性腦中風(fēng),其中缺血性腦中風(fēng)約占所有腦中風(fēng)的80%,出血性腦中風(fēng)主要分為蛛網(wǎng)膜下腔出血和腦出血,腦出血約占所有腦中風(fēng)的15%,盡管腦出血在所有腦中風(fēng)中所占比例不高,但是腦出血在所有腦中風(fēng)疾病中的死亡率居首位。tPA是目前唯一被美國國家食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于急性缺血性腦中風(fēng)的藥物,但是tPA治療后易引起溶栓性腦出血。tPA引起的溶栓性腦出血機(jī)制尚未被闡明,但是有文獻(xiàn)報(bào)道tPA通過破壞血腦屏障引起腦出血。血管性血友病因子(von Willebrand factor vWF)是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖蛋白,在凝血和血栓中起重要作用,另外在炎癥反應(yīng)系統(tǒng)中VWF作為炎癥介質(zhì)能夠通過促進(jìn)炎癥細(xì)胞的粘附、聚集進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)。有文獻(xiàn)報(bào)道VWF基因敲除能夠減少腦缺血后腦梗死體積。另外基礎(chǔ)和臨床研究表明蛛網(wǎng)膜下腔出血后血液中的vWF表達(dá)明顯上調(diào),vEF參與介導(dǎo)蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦梗死和血管痙攣的發(fā)生,vWF高表達(dá)會導(dǎo)致腦出血病人預(yù)后不良。ADAMTS13是vWF切割酶,vWF是目前已知ADAMTS13的唯一底物,ADAMTS13通過切割超聚化、功能超強(qiáng)的vWF使之成為分子量較小、活性較低的多肽,減少血栓形成和炎癥反應(yīng),減少腦缺血和蛛網(wǎng)膜下腔出血后神經(jīng)功能損傷。本實(shí)驗(yàn)采用MCAO和ICH兩種腦中風(fēng)模型,檢測這兩種動物模型對血漿vWF表達(dá)量的影響,并進(jìn)一步探討vWF切割酶rADAMTS13對tPA引起的急性腦中風(fēng)后溶栓性腦出血和腦出血后腦損傷和腦水腫的影響。實(shí)驗(yàn)方法：課題整體分成兩個(gè)部分,第一部分：重組ADAMTS13對腦出血后腦損傷和腦水腫的作用機(jī)制研究；第二部分：重組ADAMTS13通過vWF減少腦缺血后tPA引起的腦出血。第一部分實(shí)驗(yàn)方法：1.本實(shí)驗(yàn)采用二次注血法在小鼠紋狀體中注入30μL自體血構(gòu)建小鼠腦出血模型。2.用ELISA方法測定腦出血24h后血液中vWF水平變化情況。3.用HE染色法測定腦出血72h后腦損傷體積。4用干濕重法測定腦出血72h后腦組織含水量。5.用fluoro-jade B染色法檢測出血24h后血腫周邊神經(jīng)元變性情況。6.注射Evans blue觀察腦出血24h后血腦屏障通透。7.用ELISA檢測腦出血24h后IL-6表達(dá)情況。8.用MPO活性測定法測定MPO活性9.用免疫熒光技術(shù)測定腦出血24h后中性粒細(xì)胞浸潤、小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況。10.用Western Blot測定腦出血24h后ICAM-1, VCAM-1表達(dá)情況。11.用明膠酶譜法測定腦出血后24h后MMP-9的活性。第二部分實(shí)驗(yàn)方法： 1.本實(shí)驗(yàn)采用小鼠單側(cè)大腦中動脈阻塞的方法(MCAO)建立局灶性缺血/再灌注模型。2.首先我們使用ELISA法檢測缺血造模后給予tPA導(dǎo)致的小鼠血漿vWF水平變化情況。3.用紫外分光光度計(jì)測定不同處理組(vehicle、tPA、vWF、tPA+vWF、tPA+rATS、tPA+vWF+rATS)的腦出血量。4.采用明膠酶譜法分析不同處理組(sham、vehicle、tPA、rATS+tPA) MMP-9活性變化情況.5.應(yīng)用Western Blot方法檢測不同處理組(sham、vehicle、tPA、rATS+tPA)細(xì)胞核內(nèi)NF-κB表達(dá)情況6.用Western Blot方法測定不同處理組(sham、vehicle、 tPA、rATS+tPA) VEGF表達(dá)水平,利用免疫熒光法測定不同處理組(vehicle、 tPA、rATS+tPA) VEGF與CD31+的共標(biāo)數(shù)量。7.利用Western Blot技術(shù)測定不同處理組(sham、vehicle、tPA、rATS+tPA) RhoA激活的水平,通過免疫熒光計(jì)數(shù)不同組(vehicle、tPA、rATS+tPA) RhoA-GFAP共標(biāo)細(xì)胞的數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.腦出血24h后血漿中的vWF水平比Sham組有明顯升高。2.重組ADAMTS13減少腦出血后腦損傷、腦水腫和神經(jīng)元變性。3.重組ADAMTS13減少腦出血后血腦屏障破壞。4.重組ADAMTS13能夠降低腦出血后IL-6表達(dá)水平。5.重組ADAMTS13能夠抑制腦出血后MPO活性上調(diào)。6.重組ADAMTS13減少腦出血周邊區(qū)域中性粒細(xì)胞浸潤和小膠質(zhì)細(xì)胞激活。7.重組ADAMTS13減少炎癥細(xì)胞間粘結(jié)蛋白ICAM-1的表達(dá)。8.重組ADAMTS13可以減少腦出血后腦組織中的MMP-9活性。第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.小鼠缺血后給予tPA會導(dǎo)致血漿vWF水平上調(diào)。2.缺血造模后單獨(dú)給予vWF都會導(dǎo)致出血量增多,tPA共同給藥并沒有比單獨(dú)給予tPA或者vWF導(dǎo)致更多出血,提示tPA可能在同一條通路上引起缺血后腦出血；rATS和tPA共同給藥發(fā)現(xiàn)rATS可以顯著減少tPA引起的腦出血,而vWF則可以夠逆轉(zhuǎn)rATS對tPA引起腦出血的作用。3.明膠酶譜法分析發(fā)現(xiàn)tPA組相比于vehicle組MMP-9活性上調(diào),rATS能抑制tPA引起的MMP-9活性上調(diào)。4. Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明rATS+tPA組與tPA組相比,細(xì)胞核中NF-kB的水平?jīng)]有顯著性差異。5.Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明缺血后tPA使VEGF表達(dá)明顯上調(diào),rATS能抑制tPA引起的VEGF表達(dá)上調(diào)；免疫染色結(jié)果顯示缺血24h后VEGF主要與CD31陽性的血管共定位,tPA組與vehicle組相比,梗死周圍區(qū)域VEGF與CD31免疫共標(biāo)量顯著增加,rATS+tPA組與tPA組相比共標(biāo)量下降。6.Western blot分析表明腦缺血能夠激活RhoA, tPA給藥后RhoA的激活量進(jìn)一步增加,而rATS能夠減少tPA引起的RhoA激活；免疫熒光法計(jì)數(shù)梗死24h后缺血周邊區(qū)RhoA-GFAP共標(biāo)細(xì)胞的數(shù)量,rATS+tPA組與tPA組相比RhoA陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著減少。結(jié)論：1.腦出血導(dǎo)致血漿vWF表達(dá)上調(diào),重組ADAMTS13通過下調(diào)炎癥介質(zhì)、降低MMP-9活性、減少中性粒細(xì)胞細(xì)胞浸潤和小膠質(zhì)細(xì)胞激活從而減少血腦屏障損傷,最終減輕腦損傷和腦水腫。2.tPA通過vWF通路調(diào)節(jié)缺血后腦出血,rADAMTS13通過作用于vWF減少缺血后tPA治療引起的溶栓后腦出血。rADAMTS13通過下調(diào)VEGF表達(dá)、減少RhoA激活、抑制MMP-9活性最終減輕tPA引起的缺血溶栓后出血。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R651.15

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