發(fā)布時間：2018-02-11 00:20

  本文關(guān)鍵詞： 自然殺傷細胞 3型鼠肝炎病毒 暴發(fā)型肝衰竭 CCR5 MIP-1α MIP-1β RANTES　出處：《華中科技大學(xué)》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：[研究背景及目的] 暴發(fā)型肝衰竭(fulminant hepatic failure, FHF)是一種以肝損傷和功能障礙為主的臨床疾病,起病急、病情危重、癥狀及并發(fā)癥表現(xiàn)多樣,死亡率高。暴發(fā)型肝衰竭的發(fā)病率和病因因地理區(qū)域的不同而異。病毒性肝炎及藥物或毒素的攝入是其最常見的病因,全身免疫系統(tǒng)的激活是其最重要的病因。 自然殺傷(NK)細胞在乙肝病毒感染導(dǎo)致的肝衰竭的發(fā)病機制中發(fā)揮了重要的作用。NK細胞作為天然免疫重要的效應(yīng)細胞之一,是抗病毒感染的第一道防線。CD69屬于外源凝集素的C-型超家族,它作為NK細胞活化的觸發(fā)分子,同時也是NK細胞早期表達的細胞表面的活化標志。在病毒感染中,獼猴NK細胞的細胞毒活性被證實與CD69的表達相關(guān)。有研究表明,CD69的上調(diào)與NK細胞的細胞毒性和IFN-γ的產(chǎn)生相關(guān)。在我們前期研究中,發(fā)現(xiàn)MHV-3感染Balb/cJ小鼠后,肝損傷的嚴重程度與肝臟NK細胞的活化有關(guān),但肝臟CD69+NK細胞在病毒誘導(dǎo)的暴發(fā)型肝衰竭中的作用及其機制研究則較少。在本研究中,我們將進一步研究肝臟CD69+NK細胞在MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)型肝衰竭中的作用。 同時,在前期研究中我們發(fā)現(xiàn),在MHV-3介導(dǎo)的小鼠暴發(fā)性肝炎模型中,肝臟NK細胞的比例和數(shù)量顯著增加,在感染48h達到峰值,隨后至小鼠死亡仍保持著較高比例,相反在脾臟和骨髓,NK細胞比例和數(shù)量在感染后均顯著減少。盡管外周血NK細胞的比例在感染后顯著增加,但其數(shù)量卻顯著減少,表明MHV-3感染后,NK細胞從脾臟,骨髓和外周血遷移募集至肝臟。然而,在此過程中NK細胞趨化募集的機制仍不明確。在實驗前期,我們利用基因芯片技術(shù),篩選出具有差異表達的肝臟NK細胞趨化因子受體CCR5、CCR1、CXCR3以及CXCR4.而后,在MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)型肝衰竭小鼠模型中,我們檢測了肝臟NK細胞表面趨化受體CCR5、CCR1、 CXCR3和CXCR4的mRNA的表達水平隨感染時間的動態(tài)變化。綜合前期基因芯片結(jié)果,肝臟NK細胞表面趨化因子受體CCR5較其余三種受體在本模型中的mRNA表達水平發(fā)生了更為顯著及平穩(wěn)的變化。因此為了進一步深入研究肝臟NK細胞在病毒誘導(dǎo)的暴發(fā)型肝衰竭模型中的募集機制,我們對小鼠病毒性肝炎發(fā)病過程中趨化因子受體CCR5對NK細胞的趨化機制進行了初步探討。 CCR5是趨化因子受體G-蛋白偶聯(lián)受體超家族的子類成員,廣泛表達于NKT細胞,CD4+T細胞,巨噬細胞,NK細胞等多種細胞。它主要包含三個趨化因子配體：MIP-1α, MIP-1β和RANTES,也被稱為CCL-3, CCL-4和CCL-5,與之共同調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。大量的研究表明CCR5在多種肝臟疾病中發(fā)揮重要的作用：在暴發(fā)型肝衰竭患者的肝組織活檢中,肝臟CCR5配體(MIP-1α, MIP-1β和RANTES)的表達量增加,但CCR5及其配體對在暴發(fā)型肝衰竭中的作用機制仍不明確。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)CCR5在MHV-3導(dǎo)致的暴發(fā)型肝衰竭中可能通過趨化募集外周NK細胞至肝臟,從而引起肝細胞壞死及繼發(fā)性肝損傷。 因此,本研究的目的如下： (1)肝臟CD69+NK細胞在MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)型肝衰竭中的具體作用。 (2)CCR5和其相應(yīng)的趨化因子配體(CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β和CCL5/RANTES)在MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)型肝衰竭中對NK細胞遷移募集的具體機制。 [研究方法] 1.采用MHV-3腹腔途徑感染Balb/cJ小鼠建立暴發(fā)型肝衰竭模型。 2.流式細胞術(shù)用于檢測MHV-3感染0,24,48和72h后Balb/cJ小鼠肝臟、脾臟、外周血和骨髓中NK細胞CD69表達的百分率。肝臟CD69+NK細胞與肝損傷水平的相關(guān)性進行分析。 3.流式細胞術(shù)用于檢測MHV-3感染0,24,48和72h后CD69+NK細胞及CD69-NK細胞功能性標記(CD107a),活化性和抑制性受體(NKG2D和NKG2A)的表達量。胞內(nèi)因子染色法檢測其促炎細胞因子(IFN-γ、TNF-α及IL-9)的表達水平。 4.流式細胞術(shù)檢測MHV-3感染0,12,24,48和72h后Balb/cJ (?)、鼠肝臟、脾臟、外周血和骨髓中NK細胞CCR5表達的百分率。肝臟免疫熒光雙染法檢測CCR5+NK細胞在MHV-3感染后在肝臟的遷移募集情況。 5. ELISA和免疫組化法用于檢測MHV-3感染0,12,24,48和72小時后CCR5配體(MIP-1α、和RANTES)在肝臟的表達水平。實時定量PCR用于檢測在MHV-3感染0,24,48和72小時后肝細胞MIP-1α、MIP-1β和RANTES的mRNA表達水平。 6. Transwell細胞遷移實驗是用來證實MHV-3感染的肝細胞對脾臟NK細胞的趨化作用,以及CCR5和其相應(yīng)的趨化因子(MIP-1α, MIP-1β和RANTES)在脾臟NK細胞遷移至肝臟中的作用。 7.轉(zhuǎn)移過繼實驗用于評估將脾臟CCR5+NK細胞或CCR5-NK細胞通過尾靜脈注射至MHV-3感染NK細胞耗竭的Balb/cJ小鼠后,小鼠的生存時間的改變。轉(zhuǎn)移過繼實驗24小時后,HE染色用于觀察小鼠肝臟活組織病理改變；測定血清ALT和AST水平用于評估肝損傷水平；流式細胞術(shù)檢測NK細胞在肝臟的絕對計數(shù)。 [實驗結(jié)果] 1.肝臟NK細胞CD69的表達在感染后48小時(61.37±4.18%對0.92±0.12%,P0.0001)顯著增加,在感染后72小時達到最高(86.52±±2.97%對0.92±0.12%,P0.0001)。與此相似的是,脾臟和骨髓中NK細胞CD69的表達在感染后48小時也顯著增加(26.63±3.40%對1.37±0.42%,P=0.0193,脾臟；16.97±3.67%對0.80±0.12%,P=0.0454,骨髓),均在感染后72小時達到最高(66.13±6.49%對1.37±0.42%,P=0.0111,脾臟；29.13±±4.09%對0.80±0.12%,P=0.0191,骨髓)。此外,外周血中NK細胞CD69的表達與肝臟趨勢一致,在感染72小時達到最高(6.40±0.44%對1.16±0.09%,P=0.0077),但在感染48小時增加無統(tǒng)計學(xué)差異。 2.血清ALT水平在感染后48小時顯著增加,并于感染后72小時達到最高(11880.0±1174.0IU/ml對23.0±1.53IU/ml, P0.0001), AST于感染后72小時達到最高(23907±1199.0IU/ml對78.33±8.25IU/ml, P0.0001)。感染后ALT及AST水平與肝臟NK細胞CD69的表達呈高度正相關(guān)(相關(guān)性分別為r=0.989和r=0.971),且均具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.001)。 3. CD69+NK細胞上CD107a表達量在MHV-3感染48小時增加(4.67±0.38%,P0.001),72小時達到最高(12.8±0.8%,P0.001)。NKG2D在感染48小時增加(2.48±0.67%,P0.001),2小時達到最高(4.18±0.57%,P0.001; NKG2A在感染后24小時CD69-NK細胞上增加(0.85±0.21%,P0.001),而后下降。IFN-γ的表達水平在感染48小時增高(3.2±0.73%,P0.001),在72小時達到最高(3.45±0.93%,P0.001)；而TNF-α和IL-9水平在MHV-3感染48小時達到最高(10.83±0.70%和4.1±1.23%分別代表TNF-α和IL-9,P0.001)。 4. MHV-3感染后,CCR5+NK細胞在肝臟中的百分率顯著增加,與正常對照組相比,在感染后24小時達到高峰(41%,P=0.0013)。與此相反,CCR5+NK細胞的脾臟和骨髓的百分率分別為40%和36%,均在感染后12小時達到峰值,隨后下降。在外周血中CCR5+NK細胞與肝臟趨勢相同,在24小時達到峰值(31%)而后下降。將FITC-標記的抗小鼠CD3或CD49b和PE標記的抗小鼠CD195(CCR5)用于肝臟連續(xù)切片的免疫熒光染色。CD3-CD49b+CCR5+細胞代表CCR5+NK細胞。在感染早期(24小時),CCR5+NK細胞為肝臟主要浸潤的炎性細胞,而后其他炎性細胞(如T細胞)遷移至肝臟。這些結(jié)果表明,在MHV-3感染后早期CCR5+NK細胞從脾、骨髓和血液遷移募集至肝臟。 5. ELISA法用于檢測MIP-1α, MIP-1β和RANTES在肝臟中的表達,在感染后均逐漸上升,并于感染后72小時達到峰值,分別為94ng/ml (MIP-1α),0.8ng/ml (MIP-1β),和160ng/ml (RANTES)。免疫組化染色亦證明感染后72小時MIP-1α, MIP-1β和RANTES在肝臟中的表達量最高。感染后的肝細胞MIP-1α, MIP-1β, RANTES mRNA的表達呈上升趨勢,至72小時分別上升269倍,2015倍和189倍。這些結(jié)果表明MHV-3感染后,CCR5配體趨化因子的表達在肝臟顯著增加,于此同時,CCR5+NK細胞由外周器官趨化募集至肝臟。 6.MHV-3感染的肝細胞能趨化脾臟NK細胞,不僅這種趨化效應(yīng)能被抗CCR5的單克隆抗體阻斷,而且可以被抗MIP-1α,抗MIP-1β,和抗-RANTES單克隆抗體分別阻斷,但只有后兩者具有統(tǒng)計學(xué)差異。Transwell細胞趨化實驗證明,MHV-3感染的肝細胞能趨化脾臟NK細胞,同時CCR5和其相應(yīng)的趨化因子(MIP-1β, RANTES)在此趨化過程中發(fā)揮了重要作用。 7.過繼轉(zhuǎn)移實驗證實將脾臟CCR5阻斷的NK細胞經(jīng)尾靜脈回輸至MHV-3感染已將NK細胞耗竭的Balb/cJ小鼠后,可將生存時間延長至84-90h。HE染色證實過繼實驗24小時后,CCR5+NK過繼組大量炎性細胞浸潤和肝細胞死亡,血清ALT/AST水平均高于CCR5-NK過繼組,肝臟NK細胞絕對計數(shù)亦顯著增高。這些結(jié)果提示阻斷NK細胞上CCR5的表達可降低MHV-3感染后肝臟NK細胞趨化募集,從而減輕肝損傷,表明在FHF中CCR5在NK細胞的趨化募集方面起了重要的作用。 [結(jié)論] 1.在病毒誘導(dǎo)的肝衰竭模型中,Balb/cJ小鼠肝臟中CD69+NK細胞比例顯著增加,于感染后72小時達到最高,在脾臟,骨髓及外周血中也有相同的趨勢。CD69在肝臟NK細胞中的表達水平與肝損傷的嚴重程度(血清ALT及AST水平)呈正相關(guān)。肝臟CD69+NK細胞表達功能性標志(CD107a),活化性受體(NKG2D),以及胞內(nèi)因子(IFN-γ、TNF-α和IL-9)的水平在感染后48-72小時顯著上調(diào),而抑制性受體(NKG2A)的表達量則在感染早期CD69-NK細胞中相對增加。由此我們推測,肝臟CD69+NK細胞通過提高脫顆粒及細胞毒性作用,增加炎性細胞因子的產(chǎn)生參與肝細胞損傷,從而在暴發(fā)型肝衰竭的發(fā)病機制中起了重要的作用。 2.在病毒誘導(dǎo)的肝衰竭模型中,趨化因子MIP-1α, MIP-1β, RANTES在肝臟感染過程中持續(xù)增加,CCR5+NK細胞從脾臟、骨髓和血液趨化募集至肝臟,并在感染后24小時達到高峰。Transwell細胞趨化實驗表明感染的肝細胞能趨化脾臟NK細胞,并且這種效應(yīng)能被抗CCR5的單克隆抗體阻斷；中和MIP-1β和RANTES,亦可降低對脾臟NK細胞的趨化效應(yīng)。將脾臟CCR5-NK細胞經(jīng)尾靜脈回輸至MHV-3感染已將NK細胞耗竭的Balb/cJ小鼠后,可將生存時間延長至84-90h。這些結(jié)果表明,CCR5及其配體MIP-1β和RANTES在MHV-3誘導(dǎo)的肝損傷中對NK細胞向肝臟的趨化募集發(fā)揮了重要的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R575.3

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本文編號：1501794