本文關(guān)鍵詞： 急性肺損傷 具有CCCH鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)12D 促炎癥因子 核轉(zhuǎn)錄因子κB 激活蛋白-1　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景:急性肺損傷及急性呼吸窘迫綜合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome,ALI/ARDS)是致死性的呼吸系統(tǒng)危重癥,可由多種肺內(nèi)外致病因素誘發(fā),具有發(fā)病率高、病死率高的特點(diǎn)。目前ALI/ARDS的分子機(jī)制還不明確,這對(duì)其診斷、預(yù)防和治療造成了很大的限制。固有免疫介導(dǎo)的炎癥激活在ALI/ARDS的病理過程中處于核心地位。各種致病因素啟動(dòng)炎癥的級(jí)聯(lián)放大作用,造成促炎-抗炎失衡是引起炎癥反應(yīng)過度激活的關(guān)鍵。ALI/ARDS中促炎-抗炎系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制也一直是研究的熱點(diǎn)問題。具有CCCH鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)12D(zinc finger CCCH domain-containing protein12d,ZC3H12D)是一種新發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白,在人體肺組織中高表達(dá)。ZC3H12D分子具有一個(gè)獨(dú)特的鋅指結(jié)構(gòu)和一段脯氨酸富集區(qū)(Proline-rich region,PRR),具有潛在的RNA結(jié)合活性。研究發(fā)現(xiàn)ZC3H12D蛋白具有抑制腫瘤細(xì)胞增生的抗腫瘤作用以及抑制炎癥通路活化的抗炎作用,并由NF-κB轉(zhuǎn)錄表達(dá)。但是目前其具體的作用機(jī)制還是未知。我們之前通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在ALI/ARDS時(shí)ZC3H12D的表達(dá)量發(fā)生了變化,這預(yù)示ZC3H12D蛋白可能參與了ALI/ARDS的炎癥調(diào)節(jié),但ZC3H12D分子在ALI/ARDS中發(fā)揮的作用及作用的靶點(diǎn)仍需我們進(jìn)一步驗(yàn)證。研究目的:1.明確ZC3H12D是否參與LPS誘導(dǎo)的ALI;3.觀察ZC3H12D在動(dòng)物ALI模型中發(fā)揮的作用并探討相應(yīng)的機(jī)制;2.觀察ZC3H12D分子抑制炎癥反應(yīng)的作用以及對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的保護(hù)作用,并進(jìn)一步探討ZC3H12D蛋白抑制炎癥的機(jī)制。研究意義:通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和離體實(shí)驗(yàn),明確ZC3H12D分子在ALI的作用以及作用位點(diǎn),完善ALI/ARDS的促炎-抗炎調(diào)節(jié)機(jī)制,為ALI的診斷和治療提供新的證據(jù)和靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)方法:第一部分:研究LPS誘導(dǎo)的ALI動(dòng)物模型中ZC3H12D分子的表達(dá)情況1.建立動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雄性C57BL/6小鼠(20-25g)50只。使用氣管滴注LPS(10mg/kg)的方法誘導(dǎo)小鼠ALI,并將小鼠隨機(jī)分為五組:正常組(Control組),LPS致傷后2小時(shí)組(2h組),4小時(shí)組(4h組),8小時(shí)組(8h組),和12小時(shí)組(12h組),每組10只。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)小鼠肺組織滲透情況,肺濕干重比值以及促炎癥因子TNF-α,IL-1β,IL-6含量,HE染色觀察病理改變,觀察NF-κB通路激活情況(免疫組織化學(xué)染色)。2.觀察不同時(shí)間點(diǎn)ZC3H12D表達(dá)情況。q RT-PCR檢測(cè)ZC3H12D m RNA相對(duì)表達(dá)水平,Western blot檢測(cè)ZC3H12D的蛋白含量,免疫組織化學(xué)染色觀察ZC3H12D的組織細(xì)胞定位。第二部分:觀察過表達(dá)ZC3H12D對(duì)ALI的保護(hù)作用1.腺相關(guān)病毒氣管滴注感染小鼠。C57BL/6小鼠(15-18g)隨機(jī)分為正常組,ZC3H12D病毒組和GFP病毒組,每組20只。ZC3H12D病毒組和GFP病毒組分別氣管滴注ZC3H12D腺相關(guān)病毒50ul(滴度1×1012)或GFP腺相關(guān)病毒50ul(滴度1.5×1012),滴注后縫合小鼠傷口繼續(xù)飼養(yǎng)。3周后制作冰凍切片并用Western blot法檢測(cè)ZC3H12D蛋白表達(dá)量。2.觀察過表達(dá)ZC3H12D對(duì)ALI的保護(hù)作用。正常組,ZC3H12D病毒組和GFP病毒組每組隨機(jī)抽出10只小鼠,分為LPS組、LPS+GFP組、LPS+ZC3H12D組、control組、GFP組和ZC3H12D組。LPS氣管滴注致傷小鼠,12小時(shí)后檢測(cè)小鼠肺泡灌洗液細(xì)胞數(shù)目、蛋白含量和LDH水平,檢測(cè)肺濕干重比和肺組織MPO活性,檢測(cè)TNF-α,IL-1β,IL-6促炎癥因子含量,HE染色觀察病理改變,免疫組織化學(xué)染色觀察ZC3H12D組織細(xì)胞定位。Western blot檢測(cè)肺組織i NOS、Cox2和ZC3H12D表達(dá)量以及NF-κB和AP-1通路激活情況。第三部分:體外研究ZC3H12D對(duì)LPS致傷肺泡上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及抗炎機(jī)制1.觀察A549細(xì)胞中ZC3H12D表達(dá)情況。1)LPS刺激后不同時(shí)間點(diǎn)ZC3H12D表達(dá)情況:A549細(xì)胞分為六組:control組(正常組)、2h組、4h組、8h組、16h組和24h組。用LPS(25μg/ml)對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行刺激,分別刺激2 h、4 h、8 h、16 h和24 h并用Western blot檢測(cè)ZC3H12D蛋白表達(dá)量。2)不同劑量LPS刺激后ZC3H12D表達(dá)情況:A549細(xì)胞分為control組(正常組)、25μg/ml組、50μg/ml組和75μg/ml組。分別用25μg/ml、50μg/ml和75μg/ml的LPS對(duì)細(xì)胞刺激2h或16h并用Western blot檢測(cè)ZC3H12D蛋白表達(dá)量。2.觀察過表達(dá)ZC3H12D對(duì)LPS誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。A549細(xì)胞無血清無雙抗饑餓處理2小時(shí)并分別用GFP質(zhì)粒和ZC3H12D表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)然后繼續(xù)培養(yǎng)24-48h。當(dāng)兩者轉(zhuǎn)染效率在60%-70%時(shí)再分別加入50μg/ml LPS或等體積的PBS,并將細(xì)胞分為4組:control組(轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒,用PBS刺激)、ZC3H12D組(轉(zhuǎn)染ZC3H12D表達(dá)質(zhì)粒,用PBS刺激)、LPS組(轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒,用LPS刺激)和LPS+ZC3H12D組(轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒,用LPS刺激)。6小時(shí)后收集培養(yǎng)液和細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的TNFα、IL-1β和IL-6水平,Western blot檢測(cè)細(xì)胞NF-κB和AP-1通路激活情況。A549細(xì)胞在分別轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒和ZC3H12D表達(dá)質(zhì)粒后接種于96孔板,分為4組:control組、ZC3H12D組、LPS+control組和LPS+ZC3H12D組。用LPS(100ug/ml)刺激A549細(xì)胞,孵育24h,采用CCK-8法測(cè)細(xì)胞生存率。3.研究ZC3H12D抑制炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制。THP-1細(xì)胞接種于24孔板,分為3組:control組、sh ZC3H12D組和ZC3H12D組。分別用GFP質(zhì)粒,ZC3H12D表達(dá)質(zhì)粒和sh ZC3H12D慢病毒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染和感染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染和感染后用100ng/ml放線菌素D處理各組細(xì)胞。細(xì)胞于處理后1h、3h和6h行q RT-PCR,檢測(cè)c-fos、c-jun、TNFα、IL-1β、IL-6和NF-κB p65m RNA相對(duì)表達(dá)量。研究結(jié)果:第一部分:研究LPS誘導(dǎo)的ALI動(dòng)物模型中ZC3H12D分子的表達(dá)情況1.ALI動(dòng)物模型的成功構(gòu)建LPS致傷后小鼠肺泡灌洗液細(xì)胞增多(p0.05),肺組織嚴(yán)重水腫(p0.05),促炎癥因子水平急劇升高(p0.05),并出現(xiàn)典型的ALI/ARDS病理改變,表明小鼠ALI/ARDS模型建立成功。同時(shí)小鼠肺組織病理改變顯示肺損傷程度隨著時(shí)間加重,8小時(shí)損傷最重(p0.05)。LPS滴注后NF-κB p65亞基出現(xiàn)了明顯的核轉(zhuǎn)位,表明NF-κB通路激活。2.在ALI動(dòng)物肺組織中ZC3H12D表達(dá)呈先下降后上升的趨勢(shì)上述動(dòng)物模型中,ZC3H12D m RNA在致傷2小時(shí)表達(dá)最低,此后逐漸增多,致傷8小時(shí)其m RNA表達(dá)最多(p0.05);免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)ZC3H12D表達(dá)于小鼠肺泡上皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞的胞漿中,ZC3H12D蛋白的表達(dá)量也在致傷2小時(shí)表達(dá)最低,同樣在8小時(shí)達(dá)到最高(p0.05)。結(jié)果表明小鼠肺組織中ZC3H12D蛋白表達(dá)與肺組織損傷進(jìn)程具有潛在的聯(lián)系。第二部分:觀察過表達(dá)ZC3H12D對(duì)ALI小鼠的保護(hù)作用1.驗(yàn)證在體利用腺相關(guān)病毒可有效過表達(dá)ZC3H12D分子冰凍切片顯示小鼠肺組織有大量綠色熒光,顯示感染成功。免疫組織化學(xué)染色和Western blot檢測(cè)ZC3H12D表達(dá)情況。結(jié)果顯示感染ZC3H12D腺相關(guān)病毒的小鼠肺組織中ZC3H12D過表達(dá)(p0.05)。2.在LPS誘導(dǎo)小鼠ALI的模型中,過表達(dá)ZC3H12D分子可有效降低肺組織損傷過表達(dá)ZC3H12D蛋白可以顯著的改善肺組織滲透性(p0.05),減輕肺組水腫(p0.05)。肺組織MPO活性檢測(cè)和肺泡灌洗液LDH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ZC3H12D可以有效地減輕肺組織損傷(p0.05)。病理觀察也發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ZC3H12D蛋白使小鼠肺組織損傷變輕,肺泡結(jié)構(gòu)相對(duì)完整且炎癥細(xì)胞浸潤減少(p0.05)。3.過表達(dá)ZC3H12D分子對(duì)炎癥因子表達(dá)的調(diào)控作用結(jié)果顯示過表達(dá)ZC3H12D蛋白可以減少促炎癥因子TNFα、IL-1β和IL-6釋放并減少肺組織i NOS和Cox2表達(dá),Western blot檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)NF-κB和AP-1蛋白活化水平降低。表明過表達(dá)的ZC3H12D可以降低組織炎癥因子分泌,抑制炎癥通路激活,減輕組織炎癥反應(yīng),改善肺組織損傷。第三部分:體外研究ZC3H12D對(duì)LPS誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及抗炎機(jī)制1.LPS誘導(dǎo)體外培養(yǎng)肺泡上皮細(xì)胞損傷過程中ZC3H12D表達(dá)呈動(dòng)態(tài)變化。1)LPS刺激2小時(shí)ZC3H12D表達(dá)量明顯減少(p0.05),隨后不斷增加,并于16小時(shí)達(dá)到最高(p0.05)。2)不同劑量(25μg/ml、50μg/ml和75μg/ml)LPS刺激A549細(xì)胞2小時(shí)后ZC3H12D的表達(dá)量均明顯減少且呈LPS劑量依賴性(p0.05)。不同劑量(10μg/ml、25μg/ml和50μg/ml)LPS刺激A549細(xì)胞16小時(shí)后ZC3H12D表達(dá)量均明顯增加(p0.05),但之間沒有差異。2.過表達(dá)ZC3H12D分子可減輕LPS誘導(dǎo)體外培養(yǎng)肺泡上皮細(xì)胞的損傷并降低相關(guān)炎癥因子的表達(dá)隨后我們觀察了ZC3H12D對(duì)LPS致傷的A549細(xì)胞的保護(hù)作用。LPS刺激A549細(xì)胞后炎癥因子TNFα、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平明顯升高,NF-κB和AP-1也被激活(p0.05),過表達(dá)ZC3H12D蛋白可以顯著降低炎癥因子的表達(dá)以及NF-κB和AP-1活化(p0.05)。同時(shí)LPS刺激可以降低A549細(xì)胞的活力,使A549細(xì)胞生存率降低(p0.05),過表達(dá)ZC3H12D分子可以顯著提升A549細(xì)胞的生存率,對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用。3.ZC3H12D分子具有促進(jìn)c-fos、TNFα、IL-1β、IL-6和NF-κB p65m RNA水解的作用肺內(nèi)巨噬細(xì)胞是炎癥激活的始動(dòng)細(xì)胞,在LPS刺激時(shí)可以產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì),激活其他炎癥細(xì)胞引起炎癥反應(yīng)過度激活。因此最后我們使用單核巨噬細(xì)胞THP-1檢測(cè)了ZC3H12D蛋白對(duì)c-fos、c-jun、TNFα、IL-1β、IL-6和NF-κB p65m RNA穩(wěn)定性的作用,結(jié)果顯示ZC3H12D蛋白可以減弱c-fos、TNFα、IL-1β、IL-6和NF-κB p65m RNA穩(wěn)定性,加速其降解,這表明ZC3H12D蛋白能通過抑制炎癥因子生成抑制炎癥反應(yīng)。研究結(jié)論:1.內(nèi)源性鋅指蛋白ZC3H12D參與了ALI并和病程變化相關(guān),是抗炎系統(tǒng)的一部分2.過表達(dá)的ZC3H12D可以降低炎癥因子表達(dá),抑制肺組織炎癥反應(yīng)并有效地減輕肺組織損傷。說明ZC3H12D是一種ALI保護(hù)性蛋白。3.ZC3H12D具有促進(jìn)TNFα、IL-1β、IL-6、c-fos和NF-κB p65mRNA水解的功能,能通過抑制炎癥應(yīng)答對(duì)肺泡上皮細(xì)胞起到保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R563.8
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本文編號(hào)：1497855