本文關(guān)鍵詞： 急性肺損傷 具有CCCH鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)12D 促炎癥因子 核轉(zhuǎn)錄因子κB 激活蛋白-1　出處：《第四軍醫(yī)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景:急性肺損傷及急性呼吸窘迫綜合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome,ALI/ARDS)是致死性的呼吸系統(tǒng)危重癥,可由多種肺內(nèi)外致病因素誘發(fā),具有發(fā)病率高、病死率高的特點。目前ALI/ARDS的分子機制還不明確,這對其診斷、預(yù)防和治療造成了很大的限制。固有免疫介導的炎癥激活在ALI/ARDS的病理過程中處于核心地位。各種致病因素啟動炎癥的級聯(lián)放大作用,造成促炎-抗炎失衡是引起炎癥反應(yīng)過度激活的關(guān)鍵。ALI/ARDS中促炎-抗炎系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機制也一直是研究的熱點問題。具有CCCH鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)12D(zinc finger CCCH domain-containing protein12d,ZC3H12D)是一種新發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白,在人體肺組織中高表達。ZC3H12D分子具有一個獨特的鋅指結(jié)構(gòu)和一段脯氨酸富集區(qū)(Proline-rich region,PRR),具有潛在的RNA結(jié)合活性。研究發(fā)現(xiàn)ZC3H12D蛋白具有抑制腫瘤細胞增生的抗腫瘤作用以及抑制炎癥通路活化的抗炎作用,并由NF-κB轉(zhuǎn)錄表達。但是目前其具體的作用機制還是未知。我們之前通過實驗發(fā)現(xiàn)在ALI/ARDS時ZC3H12D的表達量發(fā)生了變化,這預(yù)示ZC3H12D蛋白可能參與了ALI/ARDS的炎癥調(diào)節(jié),但ZC3H12D分子在ALI/ARDS中發(fā)揮的作用及作用的靶點仍需我們進一步驗證。研究目的:1.明確ZC3H12D是否參與LPS誘導的ALI;3.觀察ZC3H12D在動物ALI模型中發(fā)揮的作用并探討相應(yīng)的機制;2.觀察ZC3H12D分子抑制炎癥反應(yīng)的作用以及對肺泡上皮細胞的保護作用,并進一步探討ZC3H12D蛋白抑制炎癥的機制。研究意義:通過體內(nèi)實驗和離體實驗,明確ZC3H12D分子在ALI的作用以及作用位點,完善ALI/ARDS的促炎-抗炎調(diào)節(jié)機制,為ALI的診斷和治療提供新的證據(jù)和靶點。實驗方法:第一部分:研究LPS誘導的ALI動物模型中ZC3H12D分子的表達情況1.建立動物模型。實驗動物:雄性C57BL/6小鼠(20-25g)50只。使用氣管滴注LPS(10mg/kg)的方法誘導小鼠ALI,并將小鼠隨機分為五組:正常組(Control組),LPS致傷后2小時組(2h組),4小時組(4h組),8小時組(8h組),和12小時組(12h組),每組10只。在相應(yīng)時間點檢測小鼠肺組織滲透情況,肺濕干重比值以及促炎癥因子TNF-α,IL-1β,IL-6含量,HE染色觀察病理改變,觀察NF-κB通路激活情況(免疫組織化學染色)。2.觀察不同時間點ZC3H12D表達情況。q RT-PCR檢測ZC3H12D m RNA相對表達水平,Western blot檢測ZC3H12D的蛋白含量,免疫組織化學染色觀察ZC3H12D的組織細胞定位。第二部分:觀察過表達ZC3H12D對ALI的保護作用1.腺相關(guān)病毒氣管滴注感染小鼠。C57BL/6小鼠(15-18g)隨機分為正常組,ZC3H12D病毒組和GFP病毒組,每組20只。ZC3H12D病毒組和GFP病毒組分別氣管滴注ZC3H12D腺相關(guān)病毒50ul(滴度1×1012)或GFP腺相關(guān)病毒50ul(滴度1.5×1012),滴注后縫合小鼠傷口繼續(xù)飼養(yǎng)。3周后制作冰凍切片并用Western blot法檢測ZC3H12D蛋白表達量。2.觀察過表達ZC3H12D對ALI的保護作用。正常組,ZC3H12D病毒組和GFP病毒組每組隨機抽出10只小鼠,分為LPS組、LPS+GFP組、LPS+ZC3H12D組、control組、GFP組和ZC3H12D組。LPS氣管滴注致傷小鼠,12小時后檢測小鼠肺泡灌洗液細胞數(shù)目、蛋白含量和LDH水平,檢測肺濕干重比和肺組織MPO活性,檢測TNF-α,IL-1β,IL-6促炎癥因子含量,HE染色觀察病理改變,免疫組織化學染色觀察ZC3H12D組織細胞定位。Western blot檢測肺組織i NOS、Cox2和ZC3H12D表達量以及NF-κB和AP-1通路激活情況。第三部分:體外研究ZC3H12D對LPS致傷肺泡上皮細胞損傷的保護作用及抗炎機制1.觀察A549細胞中ZC3H12D表達情況。1)LPS刺激后不同時間點ZC3H12D表達情況:A549細胞分為六組:control組(正常組)、2h組、4h組、8h組、16h組和24h組。用LPS(25μg/ml)對A549細胞進行刺激,分別刺激2 h、4 h、8 h、16 h和24 h并用Western blot檢測ZC3H12D蛋白表達量。2)不同劑量LPS刺激后ZC3H12D表達情況:A549細胞分為control組(正常組)、25μg/ml組、50μg/ml組和75μg/ml組。分別用25μg/ml、50μg/ml和75μg/ml的LPS對細胞刺激2h或16h并用Western blot檢測ZC3H12D蛋白表達量。2.觀察過表達ZC3H12D對LPS誘導肺上皮細胞損傷的保護作用。A549細胞無血清無雙抗饑餓處理2小時并分別用GFP質(zhì)粒和ZC3H12D表達質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)然后繼續(xù)培養(yǎng)24-48h。當兩者轉(zhuǎn)染效率在60%-70%時再分別加入50μg/ml LPS或等體積的PBS,并將細胞分為4組:control組(轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒,用PBS刺激)、ZC3H12D組(轉(zhuǎn)染ZC3H12D表達質(zhì)粒,用PBS刺激)、LPS組(轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒,用LPS刺激)和LPS+ZC3H12D組(轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒,用LPS刺激)。6小時后收集培養(yǎng)液和細胞,檢測細胞培養(yǎng)液中的TNFα、IL-1β和IL-6水平,Western blot檢測細胞NF-κB和AP-1通路激活情況。A549細胞在分別轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒和ZC3H12D表達質(zhì)粒后接種于96孔板,分為4組:control組、ZC3H12D組、LPS+control組和LPS+ZC3H12D組。用LPS(100ug/ml)刺激A549細胞,孵育24h,采用CCK-8法測細胞生存率。3.研究ZC3H12D抑制炎癥反應(yīng)的作用機制。THP-1細胞接種于24孔板,分為3組:control組、sh ZC3H12D組和ZC3H12D組。分別用GFP質(zhì)粒,ZC3H12D表達質(zhì)粒和sh ZC3H12D慢病毒對細胞進行轉(zhuǎn)染和感染。細胞轉(zhuǎn)染和感染后用100ng/ml放線菌素D處理各組細胞。細胞于處理后1h、3h和6h行q RT-PCR,檢測c-fos、c-jun、TNFα、IL-1β、IL-6和NF-κB p65m RNA相對表達量。研究結(jié)果:第一部分:研究LPS誘導的ALI動物模型中ZC3H12D分子的表達情況1.ALI動物模型的成功構(gòu)建LPS致傷后小鼠肺泡灌洗液細胞增多(p0.05),肺組織嚴重水腫(p0.05),促炎癥因子水平急劇升高(p0.05),并出現(xiàn)典型的ALI/ARDS病理改變,表明小鼠ALI/ARDS模型建立成功。同時小鼠肺組織病理改變顯示肺損傷程度隨著時間加重,8小時損傷最重(p0.05)。LPS滴注后NF-κB p65亞基出現(xiàn)了明顯的核轉(zhuǎn)位,表明NF-κB通路激活。2.在ALI動物肺組織中ZC3H12D表達呈先下降后上升的趨勢上述動物模型中,ZC3H12D m RNA在致傷2小時表達最低,此后逐漸增多,致傷8小時其m RNA表達最多(p0.05);免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)ZC3H12D表達于小鼠肺泡上皮細胞和支氣管上皮細胞的胞漿中,ZC3H12D蛋白的表達量也在致傷2小時表達最低,同樣在8小時達到最高(p0.05)。結(jié)果表明小鼠肺組織中ZC3H12D蛋白表達與肺組織損傷進程具有潛在的聯(lián)系。第二部分:觀察過表達ZC3H12D對ALI小鼠的保護作用1.驗證在體利用腺相關(guān)病毒可有效過表達ZC3H12D分子冰凍切片顯示小鼠肺組織有大量綠色熒光,顯示感染成功。免疫組織化學染色和Western blot檢測ZC3H12D表達情況。結(jié)果顯示感染ZC3H12D腺相關(guān)病毒的小鼠肺組織中ZC3H12D過表達(p0.05)。2.在LPS誘導小鼠ALI的模型中,過表達ZC3H12D分子可有效降低肺組織損傷過表達ZC3H12D蛋白可以顯著的改善肺組織滲透性(p0.05),減輕肺組水腫(p0.05)。肺組織MPO活性檢測和肺泡灌洗液LDH檢測發(fā)現(xiàn)過表達ZC3H12D可以有效地減輕肺組織損傷(p0.05)。病理觀察也發(fā)現(xiàn)過表達ZC3H12D蛋白使小鼠肺組織損傷變輕,肺泡結(jié)構(gòu)相對完整且炎癥細胞浸潤減少(p0.05)。3.過表達ZC3H12D分子對炎癥因子表達的調(diào)控作用結(jié)果顯示過表達ZC3H12D蛋白可以減少促炎癥因子TNFα、IL-1β和IL-6釋放并減少肺組織i NOS和Cox2表達,Western blot檢測也發(fā)現(xiàn)NF-κB和AP-1蛋白活化水平降低。表明過表達的ZC3H12D可以降低組織炎癥因子分泌,抑制炎癥通路激活,減輕組織炎癥反應(yīng),改善肺組織損傷。第三部分:體外研究ZC3H12D對LPS誘導肺泡上皮細胞損傷的保護作用及抗炎機制1.LPS誘導體外培養(yǎng)肺泡上皮細胞損傷過程中ZC3H12D表達呈動態(tài)變化。1)LPS刺激2小時ZC3H12D表達量明顯減少(p0.05),隨后不斷增加,并于16小時達到最高(p0.05)。2)不同劑量(25μg/ml、50μg/ml和75μg/ml)LPS刺激A549細胞2小時后ZC3H12D的表達量均明顯減少且呈LPS劑量依賴性(p0.05)。不同劑量(10μg/ml、25μg/ml和50μg/ml)LPS刺激A549細胞16小時后ZC3H12D表達量均明顯增加(p0.05),但之間沒有差異。2.過表達ZC3H12D分子可減輕LPS誘導體外培養(yǎng)肺泡上皮細胞的損傷并降低相關(guān)炎癥因子的表達隨后我們觀察了ZC3H12D對LPS致傷的A549細胞的保護作用。LPS刺激A549細胞后炎癥因子TNFα、IL-1β和IL-6的表達水平明顯升高,NF-κB和AP-1也被激活(p0.05),過表達ZC3H12D蛋白可以顯著降低炎癥因子的表達以及NF-κB和AP-1活化(p0.05)。同時LPS刺激可以降低A549細胞的活力,使A549細胞生存率降低(p0.05),過表達ZC3H12D分子可以顯著提升A549細胞的生存率,對細胞起到保護作用。3.ZC3H12D分子具有促進c-fos、TNFα、IL-1β、IL-6和NF-κB p65m RNA水解的作用肺內(nèi)巨噬細胞是炎癥激活的始動細胞,在LPS刺激時可以產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì),激活其他炎癥細胞引起炎癥反應(yīng)過度激活。因此最后我們使用單核巨噬細胞THP-1檢測了ZC3H12D蛋白對c-fos、c-jun、TNFα、IL-1β、IL-6和NF-κB p65m RNA穩(wěn)定性的作用,結(jié)果顯示ZC3H12D蛋白可以減弱c-fos、TNFα、IL-1β、IL-6和NF-κB p65m RNA穩(wěn)定性,加速其降解,這表明ZC3H12D蛋白能通過抑制炎癥因子生成抑制炎癥反應(yīng)。研究結(jié)論:1.內(nèi)源性鋅指蛋白ZC3H12D參與了ALI并和病程變化相關(guān),是抗炎系統(tǒng)的一部分2.過表達的ZC3H12D可以降低炎癥因子表達,抑制肺組織炎癥反應(yīng)并有效地減輕肺組織損傷。說明ZC3H12D是一種ALI保護性蛋白。3.ZC3H12D具有促進TNFα、IL-1β、IL-6、c-fos和NF-κB p65mRNA水解的功能,能通過抑制炎癥應(yīng)答對肺泡上皮細胞起到保護作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R563.8
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本文編號：1497855