本文關(guān)鍵詞： 腦外傷 硫化氫 神經(jīng)保護(hù) 凋亡 自噬　出處：《蘇州大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：腦外傷（Traumatic brain injury, TBI）是造成青年人神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的最常見原因，腦外傷后繼發(fā)性腦損傷是造成神經(jīng)元死亡和神經(jīng)功能障礙的主要原因。保護(hù)神經(jīng)元成為臨床治療腦外傷的重要措施。硫化氫（Hyrogen sulfide, H2S）是繼一氧化氮和一氧化碳之后發(fā)現(xiàn)的第三種具有生物活性的內(nèi)源性氣體信號分子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理狀態(tài)及各種病理改變中發(fā)揮著重要作用。本研究中，我們將探索H2S對小鼠腦外傷后神經(jīng)功能是否具有保護(hù)作用，并探索H2S與神經(jīng)細(xì)胞死亡（凋亡和自噬）之間的關(guān)系。 方法： 利用改良的自由落體裝置建立小鼠TBI模型。利用RT-PCR、Western blot、免疫組織化學(xué)、免疫熒光等技術(shù)觀察在內(nèi)源性硫化氫合成酶胱硫醚-β-合成酶在小鼠腦外傷后腦組織不同時間（1h，6h，12h，1d，2d，3d，7d）的表達(dá)變化、神經(jīng)細(xì)胞定位以及使用亞甲基蘭法檢測血漿及腦組織中內(nèi)源性硫化氫濃度。為了探討外源性硫化氫對腦外傷后神經(jīng)功能是否有保護(hù)功能，腦損傷前后不同時間點（損傷前30min、損傷后15min，30min，1h，2h，4h）給予不同濃度（0.1-45μmol/kg）硫化氫供體NaHS檢測腦組織的含水量變化。用組織缺損體積（lesion volume，LV）評估腦外傷后腦組織缺損情況，應(yīng)用行為學(xué)試驗（運動功能和Morris水迷宮試驗）評估腦外傷后神經(jīng)功能。為了進(jìn)一步探索NaHS對腦外傷后神經(jīng)保護(hù)機制，，采用腦外傷前30min腹腔注射給予NaHS，采用體視學(xué)顯微鏡觀察小鼠大腦損傷皮質(zhì)及周邊區(qū)，海馬CA1，CA3及DG區(qū)PI陽性細(xì)胞數(shù)，研究NaHS預(yù)處理對TBI引起的早期神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜完整性破壞的影響以及檢測損傷后損傷皮質(zhì)區(qū)及海馬區(qū)凋亡相關(guān)蛋白和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平，并對凋亡和自噬激活進(jìn)行探討。 結(jié)果： （1）小鼠腦外傷內(nèi)源性硫化氫濃度在血清、腦皮質(zhì)及海馬組織中變化趨勢一致，呈先降低后升高。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果證實內(nèi)源性硫化氫合成酶胱硫醚-β-合酶（cystathionine-beta-synthase，CBS）在腦組織中廣泛表達(dá)。CBS與神經(jīng)元標(biāo)記物TUJ1共定位，而與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物（GFAP）、小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物（CD11b），少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物（Cnpase）沒有共定位。腦外傷后大腦皮質(zhì)和海馬組織CBSmRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果表明隨著TBI時程的延長CBS表達(dá)逐漸降低，分別在TBI后3d和2d降到低谷后開始表達(dá)上調(diào)，呈先下降后上升的趨勢。腦外傷后CBS酶活性也呈先下降后上升的趨勢。 （2）與sham組比較，TBI后損傷側(cè)腦組織含水量呈先增加后降低的趨勢，損傷后6h含水量增加，1d達(dá)到高峰，之后略有下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。給予不同劑量外源性硫化氫供體NaHS，損傷前30min給1μmol/kg NaHS改善腦水腫較明顯。與TBI組相比，NaHS預(yù)給藥組能明顯改善腦外傷后腦缺損體積和皮質(zhì)體積缺損、減少海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元的受損情況、加快小鼠運動功能和學(xué)習(xí)記憶功能恢復(fù)。 （3）與TBI組對比，NaHS預(yù)處理（1μmol/kg）能明顯減少TBI后6h損傷皮質(zhì)區(qū)及海馬區(qū)（CA1，CA3和DG）PI陽性細(xì)胞。此外，在正常組，假手術(shù)組及損傷對側(cè)半球的皮質(zhì)區(qū)及海馬區(qū)均沒有發(fā)現(xiàn)PI陽性細(xì)胞。免疫印跡分析顯示NaHS能下調(diào)損傷皮質(zhì)區(qū)及海馬的Caspase-3的激活并上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。同時，NaHS能抑制TBI誘導(dǎo)的自噬的激活，即抑制LC3II，Beclin-1及Vps34等蛋白的激活，上調(diào)P62的蛋白水平。 結(jié)論： （1）腦外傷后腦組織內(nèi)源性硫化氫濃度及其合成酶CBS表達(dá)和酶活性隨著損傷時間延長呈先下降后上升的趨勢，提示腦外傷抑制內(nèi)源性硫化氫的生成； （2）外源性硫化氫能減輕腦外傷后腦水腫，腦缺損體積以及改善腦神經(jīng)功能，可能對腦外傷后神經(jīng)功能有保護(hù)作用； （3）硫化氫能通過抑制腦外傷后早期質(zhì)膜的破壞進(jìn)而減少神經(jīng)細(xì)胞死亡（凋亡和自噬）的激活實現(xiàn)其神經(jīng)保護(hù)機制。
[Abstract]:Objective: traumatic brain injury (Traumatic brain, injury, TBI) is the most common cause of young people nervous system dysfunction, brain secondary brain injury after trauma is a major cause of neuronal death and neurological dysfunction. Protection of neurons become important measure of the clinical treatment of traumatic brain injury. Hydrogen sulfide (Hyrogen sulfide H2S) is the discovery of third after nitric oxide and carbon monoxide gasotransmitter with biological activity, plays an important role in the state and various kinds of pathological changes in the central nervous system physiology. In this study, we will explore the H2S of mouse nerve function after traumatic brain injury and explore the protective effect of H2S, and neuronal cell death (apoptosis and autophagy). The relationship.
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本文編號：1479042