本文關鍵詞：hASCs及其CM對大鼠皮膚燒傷修復的作用及其機制研究　出處：《石河子大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的： 觀察并比較人脂肪干細胞(human adipose-derived stem cells, hASCs）、脂肪干細胞條件培養(yǎng)基（human adipose-derived stem cells-conditioned medium,hASCs-CM）和大鼠成纖維細胞（dermal fibroblast, DF）對皮膚燒傷的修復作用，尋找脂肪干細胞修復皮膚作用中的關鍵分子和可能的干預因素。 方法： 1.利用膠原酶消化法對ASCs進行分離培養(yǎng)，繪制細胞生長曲線；應用流式細胞儀對P2、P3、P5的ASCs進行表面標志物檢測；應用誘導分化培養(yǎng)基對ASCs向成脂、成軟骨和成骨方向進行誘導分化，分化后分別行油紅O、阿爾辛藍和茜素紅特殊染色鑒定；應用免疫熒光技術和PT-PCR技術對P1、P2、P5、P6細胞中Oct4和Sox2的表達情況進行分析。 2.收集獲得正常、高碳酸和TGF-β1誘導三種培養(yǎng)條件下的hASCs-CM，檢測hASCs-CM中分泌的多種生長因子VEGF、bFGF、 IGF-1和EGF。數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行方差分析。 3.膠原酶P消化法培養(yǎng)新生小鼠真皮層成纖維細胞，并進行傳代、凍存和復蘇。 4.選用200±20g的SD大鼠，建立III度燒傷模型。隨機分為鹽水對照組、MDF移植對照組、hASCs組、hASCs-CM組檢測大鼠皮膚損傷修復情況。同時在7d、15d、21d和28d采集標本，并進行拍照。行HE染色觀察大鼠燒傷皮膚組織的病理結(jié)構(gòu)，通過圖像分析軟件比較創(chuàng)面愈合率。 5.用抗人線粒體抗體檢測燒傷組織中人線粒體表達，進一步了解hASCs在損傷組織的分布情況。分別采集7d、15d、21d和損傷皮膚用免疫組化方法檢測MMP1、MMP9、III、Ⅳ型膠原蛋白的表達情況，并用IPP6.0軟件測OD值進行半定量分析，結(jié)果采用SPSS17.0軟件進行方差分析。 結(jié)果： 1.原代及傳代培養(yǎng)ASCs呈成纖維樣貼壁生長，形態(tài)均一，細胞群體倍增時間為31h。各代ASCs均表達CD29、CD44、CD90和CD105，不表達CD34和CD45，也不表達CD8a、CD56和CD69；成脂、成軟骨和成骨誘導后染色鑒定結(jié)果均為陽性；Oct4在P1、P2細胞中的表達位于細胞核內(nèi),而在P5、P6細胞的表達則位于胞質(zhì)；Sox2在P1、P2細胞的胞質(zhì)中表達，而在P5、P6細胞的胞質(zhì)中幾乎不表達。Oct4隨著傳代次數(shù)表達是逐漸減少的，Sox2在P1、P2細胞中可檢測到RNA的表達，P5、P6細胞中無RNA表達。 2.與正常對照組比較，高碳酸環(huán)境組和TGF-β1組的ASCs-CM的VEGF、EGF、bFGF和IGF-1的含量明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義（P 0.01）；TGF-β1組與高碳酸環(huán)境組的VEGF、bFGF和IGF-1相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P 0.01），EGF組差異無統(tǒng)計學意義（P=0.086）。 3.新生小鼠背部皮膚經(jīng)酶消化法后12-36h有貼壁細胞。細胞呈短梭形、多角形或不規(guī)則形。2～3d后細胞數(shù)量迅速增加成75%-90%匯合，傳代細胞逐漸變?yōu)殚L梭形，胞質(zhì)向外伸出偽足，細胞核呈卵圓形，居中。傳代后細胞形態(tài)較為均一，排列規(guī)則，呈平行狀、放射狀、旋渦狀生長。 4.統(tǒng)計燒傷創(chuàng)面的愈合率，結(jié)果表明細胞移植14d后，ASCs移植治療組的愈合率為47.63%與ASCs-CM組(40.18%)、MDF組(37.85%)和鹽水對照組（31.83%）相比具有統(tǒng)計學差異（P0.05）。在21d和28d與鹽水組相比，，ASCs-CM組和DF組有一定的促進作用。ASCs移植組的皮膚愈合速度最快，肉芽組織成熟，膠原排列整齊，毛細血管較少，皮膚結(jié)構(gòu)層次較清晰，且表面有毛長出。這提示ASCs在燒傷修復中有著很強的促進作用。 5.隨著時間的推移，ASCs主要分布在創(chuàng)面。ASCs組在14d和21d III型膠原的表達量高于其他組，但7d時的表達量與其他組無統(tǒng)計學差異。ASCs組在14d和21d MMP1的表達量高于其他組，但7d時的表達量與其他組無統(tǒng)計學差異。不同時間點各組的Ⅳ型膠原表達量較少，差異無統(tǒng)計學意義。各組不表達MMP9。 結(jié)論： 1.通過對脂肪干細胞（ASCs）的原代及傳代培養(yǎng)，研究了多能性分子Oct4和Sox2在ASCs中的表達，為ASCs的優(yōu)化培養(yǎng)提供了線索和依據(jù)。 2.在高碳酸環(huán)境和TGF-β1誘導下，ASCs-CM中的生長因子含量均升高，而TGF-β1作用更明顯，對ASCs-CM應用于臨床提供了理論依據(jù)。 3. ASCs移植組的皮膚愈合速度最快，皮膚結(jié)構(gòu)層次較清晰，且表面有毛長出。這提示ASCs在燒傷修復中有著很強的促進作用。 4. ASCs通過上調(diào)III型膠原和MMP1的表達，減少Ⅰ型膠原的合成和瘢痕形成，改善了Ⅰ/III型膠原的比例，促進燒傷的修復，為后續(xù)研究提供了思路和線索。 5.在燒傷修復的早中期，各組表達少量的Ⅳ型膠原，不表達MMP9。由于Ⅳ型膠原在表皮功能的重塑和瘢痕形成中有著重要的作用。后續(xù)研究中可延長時間觀察其變化，進一步了解其在燒傷修復中的作用。
[Abstract]:Objective:
To observe and compare the human adipose derived stem cells (human adipose-derived stem cells, hASCs), medium adipose derived stem cells (human adipose-derived stem Cells-conditioned medium conditions, hASCs-CM) and rat fibroblasts (dermal fibroblast, DF) on the skin burn repair effect, find the key molecules of adipose derived stem cells to repair the skin effect and the possible the intervention factors.
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本文編號：1361518