本文關鍵詞：Sphk1對缺血性腦損傷的雙重作用

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【摘要】：目的：研究鞘氨醇激酶1（Sphingosine kinase1，Sphk1）對缺血性腦損傷的作用機制。 方法：通過線栓堵塞小鼠大腦中動脈的方法建立缺血性腦損傷再灌注動物模型(MCAO)。使用實時定量PCR（Quantitative real-time PCR，RT-PCR）技術檢測小鼠腦缺血再灌后皮層Sphk1、Sphk2和炎癥因子的mRNA水平。通過免疫印跡法（Western blotting）檢測Sphk1蛋白在皮層缺血半暗帶的表達情況。利用免疫熒光技術（Immunofluorescence staining）觀察在腦缺血皮層表達Sphk1的細胞類型。將小鼠在缺血再灌注后隨機分成溶劑組(Vehicle)和Sphk1的抑制劑5C組，并于再灌注后3h，12h，24h，48h和72h分別給予溶劑或5C（2mg/kg），以1%2,3,5-tripheyltetrazolium chloride（TTC）染色的方法檢測小鼠在MCAO后24h和96h的腦梗死體積。使用Z-Longa評分方法觀察Sphk1抑制劑對MCAO后96h神經(jīng)功能的影響。使用側腦室注射small-interfering RNA(siRNA)的方法分別特異性地抑制MCAO后Sphk1，Sphk2和TRAF-2的基因在缺血腦皮層的表達，以TTC染色法探討Sphk1、Sphk2和TRAF-2對腦梗死體積的影響；通過檢測Evans Blue外滲情況及腦內(nèi)血紅蛋白的含量檢測Sphk1對MCAO后血腦屏障完整性的作用；以免疫共沉淀法（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）研究MCAO后腦缺血皮層中Sphk1和TRAF-2的作用。 結果：在小鼠MCAO模型中，鞘氨醇激酶1（Sphk1）在腦缺血的病理過程中發(fā)揮雙重作用。RT-PCR結果顯示：與對側的皮層相比，，在小鼠的腦皮層缺血半暗帶區(qū)Sphk1mRNA被誘導表達，而腦缺血后Sphk2mRNA的水平卻沒有發(fā)生變化；Western blotting顯示：在MCAO的動物模型中，小鼠腦皮層缺血半暗帶區(qū)Sphk1的蛋白也較對側明顯升高。免疫熒光法顯示：Sphk1高表達于缺血側皮層的半暗帶區(qū)域，而且Sphk1主要與小膠質細胞和神經(jīng)細胞標記共定位。TTC染色和Z-Longa神經(jīng)功能評分的結果顯示：Sphk1抑制劑5C、Sphk1siRNA和TRAF-2siRNA能顯著降低腦缺血再灌注后的梗死體積，5C能顯著提高MCAO后96h的神經(jīng)功能評分。Sphk1抑制劑5C和Sphk1siRNA能顯著抑制腦缺血導致的炎癥因子IL-1β、iNOS、MMP9和TNF-α mRNA在缺血皮層的誘導表達。Evans Blue結果顯示：Sphk1siRNA增加腦缺血后Evans Blue在腦內(nèi)的滲出量；血紅蛋白檢測結果也發(fā)現(xiàn)：Sphk1siRNA增加了MCAO后腦內(nèi)血紅蛋白的含量。Co-IP的結果表明在皮層缺血半暗帶Sphk1和TRAF-2相互結合在一起。 結論：小鼠MCAO后，在皮層缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元及小膠質細胞中Sphk1被誘導表達，抑制Sphk1能降低腦梗死體積和缺血后神經(jīng)炎癥應答，并改善神經(jīng)功能，但加劇血腦屏障的損傷和腦出血的風險。我們的研究表明Sphk1對缺血性腦損傷具有雙重作用，可能是腦缺血治療的新靶點。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R651.15

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