本文關(guān)鍵詞：siRNA抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1對小鼠黃韌帶骨化的影響

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【摘要】：研究背景： 黃韌帶骨化性疾病是一種臨床上常見的疾病,許多因素參與其發(fā)病過程,例如年齡、種族、基因等；生長因子、應(yīng)力改變也參與其中。但是目前病因與發(fā)病機(jī)制未明,與骨的形成有關(guān)的生長因子,比如轉(zhuǎn)化生長因子超家族們,他們在黃韌帶骨化性疾病的發(fā)病過程中扮演著非常重要的作用。國際上已經(jīng)確認(rèn)的是TGF-β1、BMP-2參與了韌帶骨化的不同時期。然而TGF-β1與BMP-2基因表達(dá)的關(guān)系及在人脊柱黃韌帶骨化進(jìn)程中的作用,國內(nèi)外報道很少。 本研究從病因?qū)W入手,模擬脊柱韌帶骨化的病理生化過程,通過siRNA技術(shù),靶向沉默小鼠黃韌帶細(xì)胞TGF-β1基因,觀察沉默TGF-β1后其對小鼠黃韌帶細(xì)胞成骨分化的影響,找尋一種高效、專一的阻止脊柱黃韌帶骨化的方法,不僅為減小該病的發(fā)病率,也為該類疾病的基礎(chǔ)研究、臨床治療拓展出一個新的思路。 目的： 運(yùn)用siRNA技術(shù)抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)在已骨化的小鼠黃韌帶成纖維細(xì)胞中的表達(dá),研究其對小鼠脊柱黃韌帶細(xì)胞骨化的影響。 方法： 應(yīng)用外科顯微器械取出小鼠胸椎黃韌帶成纖維細(xì)胞,然后離體培養(yǎng),借助人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)配制成骨誘導(dǎo)液,誘導(dǎo)細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化,對向成骨細(xì)胞方向分化的黃韌帶細(xì)胞,在顯微鏡下行形態(tài)學(xué)觀察并對其行堿性磷酸酶(ALP)染色與鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色；構(gòu)建靶向TGF-β1基因的siRNA真核表達(dá)載體(siRNA-pSilencer2.0U6-TGFβ1)并轉(zhuǎn)染已骨化的細(xì)胞,應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中TGF-β1、BMP-2的表達(dá);Real-time PCR檢測TGF-β1mRNA在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)變化；Western blotting檢測TGF-β1和BMP-2蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)變化；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對細(xì)胞中ALP、骨鈣素(OC)水平變化進(jìn)行測定。 結(jié)果： 細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)骨化成功后,對小鼠黃韌帶細(xì)胞觀察及細(xì)胞ALP染色、鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色呈現(xiàn)陽性,具有成骨細(xì)胞典型生物學(xué)特征。構(gòu)建的siRNA載體真核質(zhì)粒對細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,免疫熒光檢測顯示TGF-β1和BMP-2熒光強(qiáng)度下降;Real-timePCR檢測顯示：實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組及空白對照組比較,TGF-β1mRNA表達(dá)分別下降41.94%、47.82%,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)；Western blotting檢測顯示：實(shí)驗(yàn)組較陰性對照組和空白對照組TGF-β1/β-action蛋白比值表達(dá)分別下降35.88%、44.75%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；BMP-2/β-action蛋白比值表達(dá)分別下降81.79%、86.06%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；ELISA檢測顯示：較陰性對照組和空白對照組,實(shí)驗(yàn)組ALP表達(dá)分別下降24.14%、32.30%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；實(shí)驗(yàn)組OC分別下降17.01%、21.63%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 結(jié)論： 1.靶向TGF-β1基因的siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒能夠有效抑制己骨化的成纖維細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá),間接抑制內(nèi)源性BMP-2的表達(dá)。 2.rhBMP-2誘導(dǎo)黃韌帶細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化后,早期抑制TGF-β1基因表達(dá)可以延緩它的骨化進(jìn)展。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R686

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1226026