本文關(guān)鍵詞：siRNA抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1對(duì)小鼠黃韌帶骨化的影響

  更多相關(guān)文章： 堿性磷酸酶 骨化 骨鈣素 TGF-β1 BMP-2 siRNA

【摘要】：研究背景： 黃韌帶骨化性疾病是一種臨床上常見的疾病,許多因素參與其發(fā)病過程,例如年齡、種族、基因等；生長(zhǎng)因子、應(yīng)力改變也參與其中。但是目前病因與發(fā)病機(jī)制未明,與骨的形成有關(guān)的生長(zhǎng)因子,比如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族們,他們?cè)邳S韌帶骨化性疾病的發(fā)病過程中扮演著非常重要的作用。國際上已經(jīng)確認(rèn)的是TGF-β1、BMP-2參與了韌帶骨化的不同時(shí)期。然而TGF-β1與BMP-2基因表達(dá)的關(guān)系及在人脊柱黃韌帶骨化進(jìn)程中的作用,國內(nèi)外報(bào)道很少。 本研究從病因?qū)W入手,模擬脊柱韌帶骨化的病理生化過程,通過siRNA技術(shù),靶向沉默小鼠黃韌帶細(xì)胞TGF-β1基因,觀察沉默TGF-β1后其對(duì)小鼠黃韌帶細(xì)胞成骨分化的影響,找尋一種高效、專一的阻止脊柱黃韌帶骨化的方法,不僅為減小該病的發(fā)病率,也為該類疾病的基礎(chǔ)研究、臨床治療拓展出一個(gè)新的思路。 目的： 運(yùn)用siRNA技術(shù)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)在已骨化的小鼠黃韌帶成纖維細(xì)胞中的表達(dá),研究其對(duì)小鼠脊柱黃韌帶細(xì)胞骨化的影響。 方法： 應(yīng)用外科顯微器械取出小鼠胸椎黃韌帶成纖維細(xì)胞,然后離體培養(yǎng),借助人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)配制成骨誘導(dǎo)液,誘導(dǎo)細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化,對(duì)向成骨細(xì)胞方向分化的黃韌帶細(xì)胞,在顯微鏡下行形態(tài)學(xué)觀察并對(duì)其行堿性磷酸酶(ALP)染色與鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色；構(gòu)建靶向TGF-β1基因的siRNA真核表達(dá)載體(siRNA-pSilencer2.0U6-TGFβ1)并轉(zhuǎn)染已骨化的細(xì)胞,應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中TGF-β1、BMP-2的表達(dá);Real-time PCR檢測(cè)TGF-β1mRNA在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)變化；Western blotting檢測(cè)TGF-β1和BMP-2蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)變化；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對(duì)細(xì)胞中ALP、骨鈣素(OC)水平變化進(jìn)行測(cè)定。 結(jié)果： 細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)骨化成功后,對(duì)小鼠黃韌帶細(xì)胞觀察及細(xì)胞ALP染色、鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色呈現(xiàn)陽性,具有成骨細(xì)胞典型生物學(xué)特征。構(gòu)建的siRNA載體真核質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,免疫熒光檢測(cè)顯示TGF-β1和BMP-2熒光強(qiáng)度下降;Real-timePCR檢測(cè)顯示：實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組比較,TGF-β1mRNA表達(dá)分別下降41.94%、47.82%,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)；Western blotting檢測(cè)顯示：實(shí)驗(yàn)組較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組TGF-β1/β-action蛋白比值表達(dá)分別下降35.88%、44.75%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；BMP-2/β-action蛋白比值表達(dá)分別下降81.79%、86.06%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；ELISA檢測(cè)顯示：較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組ALP表達(dá)分別下降24.14%、32.30%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；實(shí)驗(yàn)組OC分別下降17.01%、21.63%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 結(jié)論： 1.靶向TGF-β1基因的siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒能夠有效抑制己骨化的成纖維細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá),間接抑制內(nèi)源性BMP-2的表達(dá)。 2.rhBMP-2誘導(dǎo)黃韌帶細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化后,早期抑制TGF-β1基因表達(dá)可以延緩它的骨化進(jìn)展。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R686

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 張曉,顏曉慧;骨組織工程細(xì)胞外基質(zhì)材料[J];現(xiàn)代康復(fù);2001年12期

2 王全平,李明全,李新奎,張毅,李稔生;胸椎黃韌帶骨化[J];中華骨科雜志;1996年07期

3 王哲,王全平,李新奎,高雙斌;胸椎黃韌帶骨化與腰椎黃韌帶退變的病理及基本代謝元素的比較研究[J];中華骨科雜志;1998年11期

4 鄂玲玲;劉洪臣;吳霞;王東勝;;改良大鼠下頜骨成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)與鑒定[J];中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志;2007年04期

5 劉敏,彭明惺,彭志英,鄭虎;堿性磷酸酶和骨堿性磷酸酶的臨床應(yīng)用[J];中華小兒外科雜志;2002年03期

6 王運(yùn)濤,鄭啟新,郭曉東;野生型Smad3基因促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2004年18期

7 錢齊榮,賈連順,戴力揚(yáng),倪斌;多節(jié)段胸椎黃韌帶骨化癥2例報(bào)告[J];中國脊柱脊髓雜志;1997年01期

，

本文編號(hào)：1226026