本文關(guān)鍵詞：發(fā)形霞水母溶血活性蛋白和多肽生長因子的分離純化及其活性研究

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【摘要】：水母（Jellyfish）屬刺胞動物門（Cnidaria），是一類低等的無脊椎海洋浮游動物，種類繁多，數(shù)量極大，分布廣泛，在海洋生態(tài)系統(tǒng)中占有重要地位。水母的觸手和口腕上分布大量刺絲囊，其內(nèi)含有的毒液成分復雜，除毒素外，還包括多種酶類、組胺、生物活性肽等附屬成分，分離純化和鑒定水母毒素中的生物活性物質(zhì)是利用水母毒素的重要手段和先決條件。本論文以近年來在我國東南海域經(jīng)常大規(guī)模出現(xiàn)的發(fā)形霞水母（Cyanea capillata）為研究對象，主要研究水母毒素的提取制備方法、分離純化、鑒定及其生物活性等。 方法 第一章：發(fā)形霞水母毒素的溶血活性研究及其分離純化 第一節(jié)，以本實驗室常規(guī)制備的水母粗毒樣品觸手提取物（tentacle extract，TE）為研究對象，跟蹤測定樣品的蛋白濃度、溶血活性，并結(jié)合SDS-PAGE分析，明確各種理化因素和處理方法對TE蛋白穩(wěn)定性和溶血活性的影響；利用陰離子交換層析和凝膠過濾層析兩種純化方法，對經(jīng)過40℃水浴1h預處理的TE進行定向分離純化溶血活性蛋白。 第二節(jié)，采用劇烈機械振蕩和離心相結(jié)合的方法快速制備水母粗毒樣品口腕提取物（oral arms extract，OAE），顯微觀察制備過程中口腕上刺絲囊的發(fā)射情況；研究脫鹽、凍干、超濾等處理方法對OAE溶血活性的影響，分別利用陰離子交換層析和凝膠過濾層析兩種純化方法定向分離OAE中的溶血活性蛋白。 第二章：發(fā)形霞水母多肽生長因子的分離純化、鑒定及其活性研究 首先，制備兩種水母粗毒樣品：快速制備的觸手提取物（rapid preparation tentacleextract，rpTE）和粗刺絲囊毒素（crude nematocyst venom，cNV），測定兩種樣品的溶血活性等參數(shù)，在制備rpTE和cNV過程中顯微觀察刺絲囊的發(fā)射和破碎情況。其次，利用凝膠過濾層析和HPLC反相層析，結(jié)合MALDI-TOF質(zhì)譜分析，對rpTE和cNV分別進行分離純化。再次，測定純化出多肽的N端序列，利用還原衍生反應、酶解反應等生物化學實驗方法，結(jié)合MALDI-TOF質(zhì)譜分析，鑒定5782.9Da多肽的全長氨基酸序列，并作生物信息學分析。最后，采用濾紙片擴散法、分光光度法和CCK-8法分別研究多肽生長因子Cc-GRN-1（5782.9Da多肽）的抗菌活性、抗凝血酶活性和細胞增殖活性。 結(jié)果 第一章：發(fā)形霞水母毒素的溶血活性研究及其分離純化 第一節(jié)，TE溶血活性的劑量反應曲線呈“S”形，其半數(shù)溶血分數(shù)HU50=226μg/mL；40℃水浴1h能去除TE中大量雜蛋白，但TE仍保持顯著溶血活性；TE在4℃條件下放置28d，其溶血活性保持穩(wěn)定，25℃條件下3d內(nèi)其溶血活性變化不明顯；pH值對TE溶血活性的影響呈鐘形曲線，在pH6-11之間活性相對穩(wěn)定，pH=8時TE的溶血活性最強；TE被100kDa和10kDa超濾管分別濃縮了1.3倍和1.5倍；不同緩沖液對TE蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性的影響顯著，飽和度大于26%的硫酸銨溶液透析TE產(chǎn)生的沉淀有溶血活性。陰離子交換層析后，檢測到第一個洗脫峰組分有溶血活性，該組分利用凝膠過濾層析進一步分離純化，得到兩個洗脫峰，都沒有溶血活性，SDS-PAGE分析顯示在第二個洗脫峰組分的泳道上有四條蛋白條帶，其中31kDa條帶最明顯，20kDa條帶次之，36kDa條帶和65kDa條帶較弱。 第二節(jié)，OAE的半數(shù)溶血分數(shù)HU50=95μg/mL，口腕上的刺絲囊主要有梭形、橢圓形和球形三種類型，梭形刺絲囊最大，長徑在26-30μm之間，橢圓形刺絲囊次之，長徑為14μm左右，球形刺絲囊最小，直徑約為4μm；在數(shù)量上，球形刺絲囊最多，橢圓形刺絲囊次之，梭形刺絲囊最少；直接凍干處理再復溶的OAE溶血活性保持不變，但OAE被脫鹽后，凍干再復溶，其溶血活性消失；用100kDa超濾管濃縮OAE，濃縮液有溶血活性，濃縮后的濾液沒有溶血活性；陰離子交換層析的穿透峰和洗脫峰組分都沒有溶血活性，凝膠過濾層析前OAE用3kDa超濾管濃縮，超濾過程中析出的沉淀有溶血活性，層析后的5個洗脫峰組分都沒有溶血活性。 第二章：發(fā)形霞水母多肽生長因子的分離純化、鑒定及其活性研究 首先，觸手上的刺絲囊主要有梭形、橢圓形和球形三種類型，梭形刺絲囊最大，長徑在26-30μm之間，橢圓形刺絲囊次之，長徑為14μm左右，，球形刺絲囊最小，直徑約為4μm；在數(shù)量上，梭形刺絲囊最多，球形刺絲囊次之，橢圓形刺絲囊最少；rpTE溶血活性的劑量反應曲線呈“S”形，其半數(shù)溶血分數(shù)HU50=200μg/mL，cNV的半數(shù)溶血分數(shù)HU50=40μg/mL。其次，從rpTE中純化出5805.3Da、5782.9Da、5668.3Da和5747.4Da四個多肽，從cNV中純化出5805.3Da、5782.9Da、5691.0Da、5861.3Da和5747.4Da五個多肽，其中5805.3Da、5782.9Da和5747.4Da三個多肽從rpTE和cNV中都能純化得到。再次，5782.9Da多肽的全長氨基酸序列為NVICPDGTSFCASGQTCCKLSSGSYGCCPLPNAVCCSDGVHCCPSGTTCDVSQGTCL(I)R，由58個氨基酸組成，其中含有12個半胱氨酸；5805.3Da多肽N端序列為NVICPDGTSYCATGQTCCKLSSGGYGCCPL，5747.4Da多肽N端序列為VICPDGTSYCATGQT，5668.3Da多肽N端序列為VICPDGTSFCASGQTCCVLSSGQY，四個多肽的氨基酸序列相似性很高；5782.9Da多肽序列注釋顯示，它屬于生長因子中的顆粒體蛋白家族（命名為多肽生長因子Cc-GRN-1），理論等電點為5.29，分子內(nèi)有6個二硫鍵，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、水溶性強，屬于分泌型多肽，含有8個糖基化位點和5個磷酸化位點；多重序列比對提示多肽生長因子Cc-GRN-1有抗菌活性、抗凝血酶活性；功能注釋和代謝通路分析顯示，多肽生長因子Cc-GRN-1主要發(fā)揮蛋白結(jié)合和生長因子活性兩種分子功能，參與應激反應、蛋白水解作用、信號轉(zhuǎn)導、囊胚孵化、胚胎著床、上皮細胞增殖的正向調(diào)控、神經(jīng)肽信號通路、對細菌的防御反應等多種生物學過程。最后，滴加100g/mL多肽生長因子Cc-GRN-1溶液的濾紙片周圍沒有出現(xiàn)抑菌圈；濃度為1g/mL、2g/mL、4g/mL、8g/mL、12g/mL、25g/mL、50g/mL和100g/mL的多肽生長因子Cc-GRN-1溶液對凝血酶的抑制率都接近于零；隨著多肽生長因子Cc-GRN-1濃度的增加，A549細胞、HUVEC細胞、HaCaT細胞、A9細胞和L-929細胞的細胞增殖率逐漸增大，且與空白對照相比有顯著性差異，但NRK-52E細胞的細胞增殖率沒有明顯的增大或減小。 結(jié)論 1.40℃水浴1h預處理顯著減少TE中非活性蛋白組分，并降低樣品黏性；4℃和pH8.0是TE保持蛋白穩(wěn)定性和溶血活性的最適條件；飽和度大于26%的硫酸銨鹽析作用可以富集TE中的溶血活性蛋白；凍干處理不影響OAE的溶血活性，鹽溶液環(huán)境有利于OAE溶血活性的保持；發(fā)形霞水母毒素溶血活性蛋白的分子量大于100kDa，可能是多亞基組成的復雜蛋白，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、溶解性弱，易受多種理化條件和處理方法的影響而聚集形成有溶血活性的沉淀，并且在純化過程中溶血活性易于降低或喪失。 2.四種水母粗毒樣品溶血活性的強弱關(guān)系：cNV OAE rpTE TE，制備OAE和rpTE方法中的劇烈機械振蕩能有效刺激刺絲囊發(fā)射，并釋放毒液，較好地減少了組織蛋白或非毒素蛋白的混入和干擾，先分離制備刺絲囊再破碎提取毒素的方法可以大大提高水母粗毒樣品的純度和質(zhì)量，但制備粗毒樣品的量較少。 3.利用凝膠過濾層析和HPLC反相層析，結(jié)合MALDI-TOF質(zhì)譜分析，從rpTE和cNV中純化出了5805.3Da、5782.9Da、5668.3Da、5747.4Da、5691.0Da和5861.3Da六個分子量相近的多肽，已鑒定的5782.9Da、5805.3Da、5747.4Da和5668.3Da四個多肽的氨基酸序列相似性很高，其中5782.9Da多肽（多肽生長因子Cc-GRN-1）為生長因子中的顆粒體蛋白，這提示我們從發(fā)形霞水母觸手（特別是刺絲囊）中發(fā)現(xiàn)了一組分子量相近、同源性很高的多肽生長因子。 4.多肽生長因子Cc-GRN-1沒有抗菌活性、抗凝血酶活性，對A549細胞、HUVEC細胞、HaCaT細胞、A9細胞和L-929細胞有顯著的促增殖作用，但對NRK-52E細胞沒有明顯的細胞增殖或毒性作用。
【關(guān)鍵詞】：發(fā)形霞水母 毒素制備 溶血活性 分離純化 顆粒體蛋白 多肽生長因子
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：Q51;R646
【目錄】：

• 摘要5-9
• Abstract9-14
• 縮略詞表14-16
• 前言16-21
• 第一章 發(fā)形霞水母毒素的溶血活性研究及其分離純化21-57
• 第一節(jié) 水母觸手提取物的溶血活性及其分離純化22-44
• 第二節(jié) 水母口腕提取物的溶血活性及其分離純化44-55
• 第三節(jié) 小結(jié)55-57
• 第二章 發(fā)形霞水母多肽生長因子的分離純化、鑒定及其活性研究57-102
• 第一節(jié) 水母毒素的提取與制備58-65
• 第二節(jié) 水母多肽生長因子的分離純化65-76
• 第三節(jié) 水母多肽生長因子的鑒定76-94
• 第四節(jié) 水母多肽生長因子的生物活性研究94-100
• 第五節(jié) 小結(jié)100-102
• 結(jié)論102-103
• 創(chuàng)新點103-104
• 附錄104-138
• 參考文獻138-143
• 綜述 水母毒素生物活性多樣性及其蜇傷防治143-152
• 參考文獻148-152
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說明152-153
• 致謝153

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 王艷,周培根,戚曉玉;海洋生物中毒素的研究進展[J];上海水產(chǎn)大學學報;2002年03期

2 洪惠馨;水母和海蜇[J];生物學通報;2002年02期

本文編號：1089602