本文關(guān)鍵詞：EB病毒EBER2變異型通過PKR抑制鼻咽癌細胞凋亡的作用研究

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【摘要】：背景和目的:EB病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)編碼小RNA(EBV-encoded RNAs,EBERs,包括EBER1和EBER2)的致癌作用已在多種細胞系中得到證實。我們前期對EBERs基因多態(tài)性的研究中發(fā)現(xiàn)在EBER2基因發(fā)生6處共有突變的EB-8m變異型可能與鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)尤其是高發(fā)區(qū)NPC的發(fā)生相關(guān)。以往有研究表明EBERs通過結(jié)合RNA激活蛋白激酶(RNA-activated protein kinase,PKR)并抑制其磷酸化從而抵抗干擾素-α(Interferonα,IFN-α)誘導(dǎo)的凋亡。本研究旨在明確變異型EBER2對NPC細胞增殖和IFN-α誘導(dǎo)細胞凋亡的作用,探討其對PKR結(jié)合和磷酸化以及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響,為明確EBER2及其變異型參與NPC的分子機制提供依據(jù)。方法:以只含EBER2基因的B95-8型和EB-8m變異型基因慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的EBV陰性NPC細胞系CNE1和HONE1為研究對象,進行細胞增殖實驗和IFN-α細胞凋亡誘導(dǎo)實驗;Western blot檢測PKR、轉(zhuǎn)錄起始因子e IF2α和核轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的磷酸化蛋白表達水平及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達情況;PKR基因瞬時轉(zhuǎn)染EBER2陽性細胞后進行RNA蛋白結(jié)合免疫共沉淀,采用Real-time PCR和Western blot分別檢測免疫共沉淀產(chǎn)物中EBER2 RNA和PKR蛋白水平。結(jié)果:(1)與轉(zhuǎn)染原型EBER2細胞及轉(zhuǎn)染載體病毒(不含EBER2)的對照細胞比較,轉(zhuǎn)染變異型EBER2細胞MTT吸光度值和平板克隆形成率增高(P均小于0.05),原型和對照之間尚無差異。(2)轉(zhuǎn)染原型和變異型EBER2細胞的細胞存活率高于對照細胞,凋亡細胞百分數(shù)低于對照細胞,差異均有顯著性(P0.05),且轉(zhuǎn)染變異型EBER2細胞凋亡百分數(shù)亦低于轉(zhuǎn)染原型EBER2細胞,差異有顯著性(P0.05)。(3)與轉(zhuǎn)染對照病毒細胞及未轉(zhuǎn)染細胞比較,轉(zhuǎn)染原型和變異型EBER2細胞中磷酸化PKR、e IF2α和c-Jun表達下降,Bcl-2表達上調(diào);轉(zhuǎn)染變異型EBER2細胞較轉(zhuǎn)染原型EBER2細胞磷酸化PKR表達下降更為明顯。(4)原型和變異型EBER2均可與PKR發(fā)生免疫共沉淀,且EB-8m變異型EBER2在免疫共沉淀產(chǎn)物中的富集倍數(shù)高于原型EBER2,差異有顯著性(P0.05)。結(jié)論:(1)EB-8m變異型EBER2可提高NPC細胞增殖及抗凋亡能力。(2)EBER2可通過結(jié)合PKR并抑制其發(fā)生磷酸化,同時抑制e IF2α和c-Jun磷酸化,上調(diào)Bcl-2蛋白表達而抵抗IFN-α誘導(dǎo)的細胞凋亡,EB-8m變異型EBER2可能增強EBER2與PKR的結(jié)合作用及對PKR磷酸化的抑制作用。
【關(guān)鍵詞】：EB病毒 EBER2 PKR 細胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R373
【目錄】：

• 摘要2-3
• Abstract3-6
• 引言6-8
• 第一章 材料與方法8-19
• 1.1 儀器、試劑和耗材8-10
• 1.2 慢病毒載體構(gòu)建10
• 1.3 慢病毒轉(zhuǎn)染目的細胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞篩選10-11
• 1.4 細胞增殖實驗11
• 1.5 細胞凋亡誘導(dǎo)實驗11-12
• 1.6 Western-blot檢測蛋白表達12-13
• 1.7 RNA蛋白結(jié)合免疫共沉淀13-18
• 1.8 統(tǒng)計學(xué)分析18-19
• 第二章 結(jié)果19-28
• 2.1 EBERs基因結(jié)構(gòu)及EB-8m變異型突變堿基位置19
• 2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞EBER2基因表達19-21
• 2.3 EBER2原型和變異型基因?qū)PC細胞增殖的影響21-23
• 2.4 細胞凋亡誘導(dǎo)結(jié)果23-25
• 2.5 EBER2轉(zhuǎn)染細胞中PKR、eIF2α、c-Jun以及Bcl-2 的表達情況25-26
• 2.6 pcDNA3.1-PKR-FLAG序列鑒定結(jié)果26-27
• 2.7 免疫共沉淀產(chǎn)物中EBER2 RNA和PKR蛋白檢測27-28
• 第三章 討論28-32
• 研究結(jié)論32-33
• 參考文獻33-39
• 綜述39-56
• 參考文獻47-56
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果56-57
• 致謝57-58

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 楊萬水;楊馳;鄭家偉;高靜;張薇;張志愿;項永兵;;上海市區(qū)鼻咽癌發(fā)病率趨勢分析[J];中華流行病學(xué)雜志;2009年11期

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本文編號：638073