人腺病毒(Human Adenovirus,HAdV)感染可引起多種臨床綜合征,包括呼吸道疾病、結(jié)膜炎、膀胱炎、腸胃炎、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。目前已發(fā)現(xiàn)和報(bào)道的腺病毒血清型有90余種,其主要感染人群有嬰幼兒、免疫力低下病人以及訓(xùn)練營新兵等。然而目前針對腺病毒感染并沒有有效的治療藥物,美國國防部和以色列梯瓦制藥工業(yè)有限公司聯(lián)合研制的4型和7型口服新病毒活疫苗在軍隊(duì)新兵預(yù)防腺病毒疫情爆發(fā)方面顯示了顯著的效果,然而我國并沒有相關(guān)的疫苗上市或者用于軍人免疫的特需疫苗。近年來我國地方和軍隊(duì)都有較大規(guī)模的腺病毒疫情爆發(fā),其中以HAdV-7引起的感染最為常見,造成的危害也最為嚴(yán)重,因此發(fā)展HAdV-7疫苗具有重要意義。中和抗體作為HAdV-7流行病學(xué)研究的重要研究對象,也是HAdV-7疫苗免疫效果評價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)。傳統(tǒng)HAdV-7中和抗體的檢測方法是基于細(xì)胞病變法(CPE),該方法具有周期性長(4~8天),靈敏度低,穩(wěn)定性差等不足之處~([1])。本研究中建立了利用報(bào)告基因法定量檢測HAdV-7中和抗體的新方法。我們利用同源重組構(gòu)建了E1區(qū)和E3區(qū)部分缺失,并在E1區(qū)缺失部位嵌入帶有熒光素酶表達(dá)框的pAd7-Luc重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,從而包裝出能夠表達(dá)熒光素酶報(bào)告基因的Ad7重組病毒(Ad7-Luc)�；贏d7-Luc重組病毒建立了報(bào)告基因檢測HAdV-7中和抗體的方法,并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果顯示:構(gòu)建的Ad7-Luc重組病毒,病毒滴度可達(dá)4.85×10~8 IFU/mL。報(bào)告基因檢測法與傳統(tǒng)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)法檢測HAdV-7中和抗體具有良好的一致性(R=0.8612,P0.0001),批內(nèi)和批間差異分別在10%和20%以內(nèi)。與傳統(tǒng)的細(xì)胞病變方法相比,HAdV-7中和抗體報(bào)告基因檢測方法更加快速(1天)、靈敏、準(zhǔn)確,適用于HAdV-7血清流行病學(xué)調(diào)查以及相關(guān)疫苗的中和抗體檢測。利用該方法我們共檢測了北京和泰州兩地375份健康成人血清樣本,結(jié)果顯示:北京和泰州兩地HAdV-7血清陽性率分別為56.47%(144/255)和57.50%(69/120),其中低滴度水平(12~200)陽性血清數(shù)分別占總陽性血清樣本的70.14%(101/144)和85.51%(59/69)。與實(shí)驗(yàn)室前期HAdV-4和HAdV-5檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)兩地HAdV-7血清陽性率顯著低于HAdV-5(p0.001),而與HAdV-4無顯著性差異(p0.05);同時(shí)發(fā)現(xiàn)HAdV-7血清陽性率并不存在性別間差異,并隨著年齡的增長呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。接下來,進(jìn)行了HAdV-7候選疫苗的免疫學(xué)評價(jià)研究,評價(jià)不同形式的HAdV-7活病毒疫苗的在不同動(dòng)物上的免疫效果。首先以BALB/c,C57 BL/6和金黃地鼠作為動(dòng)物模型,肌肉注射和腹腔注射活的HAdV-7,結(jié)果顯示:兩種免疫途徑均能檢測到較高水平HAdV-7中和抗體,中和抗體在免疫后4周達(dá)到峰值,隨后逐漸降低,但能長期維持一定的水平。然后以BALB/c小鼠作為動(dòng)物模型,通過肌肉給藥研究疫苗的免疫劑量依賴關(guān)系以及細(xì)胞免疫反應(yīng)。結(jié)果顯示:低劑量HAdV-7(1×10~5 IFU/只)能使50%的小鼠產(chǎn)生中和抗體,隨著免疫劑量的增加中和抗體水平顯著升高;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測HAdV-7免疫14天后的小鼠脾臟細(xì)胞,結(jié)果顯示:只檢測到特異性CD4~+T細(xì)胞反應(yīng),未檢測到特異性CD8~+T細(xì)胞反應(yīng)。最后,以恒河猴作為動(dòng)物模型,通過肌肉注射活病毒和口服活病毒片劑的方式進(jìn)行免疫,進(jìn)行中和抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(流式細(xì)胞術(shù)和ELISPOT)。結(jié)果顯示:肌肉免疫后能迅速激發(fā)體液免疫反應(yīng),中和抗體在14天左右達(dá)到峰值,隨后顯著降低但仍能長時(shí)間維持一定水平;口服給藥組并未產(chǎn)生中和抗體。細(xì)胞免疫反應(yīng)方面,肌肉注射組在免疫后7天,特異性CD8~+T細(xì)胞反應(yīng)(IFN-γ、TNF-α、IL-2和CD107a)和CD4~+T細(xì)胞反應(yīng)(IFN-γ、IL-2和CD154)顯著上調(diào),14天后顯著下降;口服免疫途徑并未檢測到特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)。我們推測HAdV-7活疫苗口服片劑無法順利到達(dá)恒河猴的腸部釋放并感染黏膜上皮細(xì)胞,從而無法進(jìn)一步刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。綜上所述,本研究建立的利用熒光素酶報(bào)告基因檢測HAdV-7中和抗體的方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn),適用于HAdV-7血清流行病學(xué)調(diào)查以及相關(guān)疫苗研究的中和抗體檢測。HAdV-7候選疫苗的免疫學(xué)評價(jià)研究發(fā)現(xiàn)肌肉注射免疫方式能夠快速激發(fā)體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng),然而口服活疫苗仍需進(jìn)一步優(yōu)化和研究。
【學(xué)位單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

圖 1 1979-2016 年我國腺病毒疫情流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)Figure 1 Epidemiological statistics of adenovirus outbreaks from 1979 to 2China中和抗體作為病原學(xué)流行病研究的重要指標(biāo)，反應(yīng)了人群中病毒感染水可以幫助了解各地腺病毒流行情況，有助于預(yù)測潛在的腺病毒疫情爆發(fā)。然目前國內(nèi)外 7 型腺病毒血清中和抗體的研究卻鮮有報(bào)道，國內(nèi)針對 7 型腺病群感染水平的調(diào)查和研究最早還要追溯到 20 世紀(jì) 90 年代[40,41]，最新的報(bào)道一篇，是 2018 年由廣州呼研所的陳凌教授和中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康院馮立強(qiáng)教授合作完成了湖南郴州地區(qū) 1302 份血清中和抗體的檢測，這些研中在我國南方部分地區(qū)，北部地區(qū)人群 7 型腺病毒感染情況仍然未知。目前檢測血清腺病毒中和抗體的方法有兩類：一種是細(xì)胞病變法，腺病抗體孵育后，觀察感染細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）；另一種是報(bào)告基因血清中的中和抗體能夠抑制病毒感染從而降低報(bào)告基因的表達(dá)水平，檢測報(bào)因的表達(dá)水平，從而通過相應(yīng)的抑制程度來確定中和抗體水平，常用的報(bào)告有β-半乳糖苷酶（LacZ）、綠色熒光蛋白（GFP）、分泌型堿性磷酸酶（S和熒光素酶（Luciferase）。傳統(tǒng)的 CPE 法周期長（4~8 天），主觀性強(qiáng)，靈

第 6 頁圖 1.1 Ad7-Luc 重組病毒構(gòu)建流程圖Figure 1.1 Schematic diagram of Ad7-Luc recombinant virus construction1.1 材料與方法1.1.1 材料1.1.1.1 毒株、菌株、細(xì)胞和動(dòng)物HAdV-7 毒株兩株：一株由本室保存（毒株待定），候選疫苗株由康希諾生

軍事科學(xué)院碩士學(xué)位論文1.2 結(jié)果1.2.1 HAdV-7 毒株的培養(yǎng)與鑒定首先確定了本室保存毒株具體種類，根據(jù) HAdV-7 毒株（AY594255）基因組序設(shè)計(jì)了 5 對引物，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增與測序（圖 1果分析顯示：5 段序列與 HAdV-7-GZ08（GQ478341）的匹配程度最高以上，由此我們可以確定該毒株為我國廣州地區(qū)流行并分離鑒定的 Ad毒株。
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;美科學(xué)家發(fā)現(xiàn)HIV中和抗體[J];浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志;2010年09期

2 ;病毒的中和抗體[J];廣州醫(yī)藥;1996年02期

3 朱炳法;;AIDS疫苗的展望[J];國外醫(yī)學(xué)(微生物學(xué)分冊);1988年02期

4 朱炳法;;可溶性CD_4能中和HIV-1[J];國外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊);1988年05期

5 路福順;關(guān)于艾滋病的預(yù)防接種[J];國外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊);1989年04期

6 鞠斌;李丹;任莉;郝彥玲;張蕾;王碩;魏民;邵一鳴;;中國HIV-1感染者中分離單克隆中和抗體的初步研究[J];中國病毒病雜志;2017年05期

7 黃欽,曹韻貞;HIV-1(Human immunodeficiency virus type1)中和抗體研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).病毒學(xué)分冊;2000年03期

8 朱果;;雞新城疫病的防御與分泌性中和抗體及循環(huán)中和抗體的關(guān)系——粘膜感染病毒的感染和免疫(2)(摘譯)[J];山東養(yǎng)禽;1980年01期

9 孫明;李琦涵;;新一代抗HIV-1中和抗體的研究進(jìn)展[J];中國病毒病雜志;2014年02期

10 ;科學(xué)家摸清HIV-1中和抗體產(chǎn)生途徑[J];浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志;2014年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 孫有湘;基于HIV-1中和抗體的基因治療研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2018年

2 王倩;中國HIV/AIDS患者及疾病長期不進(jìn)展者中和抗體水平及其保守表位氨基酸變異研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2005年

3 許信剛;逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的丙型肝炎病毒（HCV）囊膜蛋白基因的表達(dá)及抗HCV中和抗體的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2005年

4 王錚;HIV-1 Thai-B亞型感染性克隆的構(gòu)建及其在中和抗體檢測和疫苗研究中的初步應(yīng)用[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2008年

5 丁瑩瑩;宿主抗腸病毒非中和抗體反應(yīng)特點(diǎn)的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2016年

6 喬媛媛;HIV-1單克隆中和抗體Y498的抗病毒活性和機(jī)制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

7 周慧;活化廣譜抗流感病毒中和抗體的組合疫苗研究[D];蘇州大學(xué);2016年

8 鞠斌;白介素-21調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫反應(yīng)的研究及HIV-1單克隆廣譜中和抗體的鑒定[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2016年

9 劉媛;高變區(qū)1抑制丙型肝炎病毒包膜蛋白E2誘生交叉中和抗體[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2011年

10 李真光;中和抗體結(jié)合MCP-1對狂犬病暴露后預(yù)防研究及嵌合糖蛋白重組狂犬病病毒的構(gòu)建[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 李建華;人7型腺病毒血清流行病學(xué)研究和候選疫苗的免疫學(xué)評價(jià)[D];軍事科學(xué)院;2019年

2 周奇;山東地區(qū)正常人群腺病毒感染狀況的調(diào)查分析[D];青島大學(xué);2016年

3 喬佳明;人免疫缺陷病毒1型包膜蛋白gp120制備及中和單抗篩選[D];廈門大學(xué);2018年

4 李春林;利用B細(xì)胞培養(yǎng)從人感染者篩選并獲得H7N9高親和力中和抗體[D];廣州醫(yī)科大學(xué);2018年

5 高穎;血清HBV中和抗體水平檢測方法的建立及初步應(yīng)用[D];廈門大學(xué);2017年

6 周旋;基于MERS-CoV RBD與DPP4受體互作建立新型不依賴活毒的中和抗體測方法[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2018年

7 陳杰;馬傳貧病毒弱毒疫苗免疫馬匹后中和抗體變化規(guī)律研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

8 張紅普;狂犬病口服疫苗的誘餌制作及免疫中和抗體檢測[D];廣西大學(xué);2012年

9 李真;高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（HuN4-F112株）ORF1a誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生區(qū)域的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2017年

10 馮穎;人14型和55型腺病毒中和抗體表位分析[D];廣州醫(yī)科大學(xué);2017年

本文編號：2892974