人腺病毒(Human Adenovirus,HAdV)感染可引起多種臨床綜合征,包括呼吸道疾病、結膜炎、膀胱炎、腸胃炎、神經系統(tǒng)疾病等。目前已發(fā)現和報道的腺病毒血清型有90余種,其主要感染人群有嬰幼兒、免疫力低下病人以及訓練營新兵等。然而目前針對腺病毒感染并沒有有效的治療藥物,美國國防部和以色列梯瓦制藥工業(yè)有限公司聯合研制的4型和7型口服新病毒活疫苗在軍隊新兵預防腺病毒疫情爆發(fā)方面顯示了顯著的效果,然而我國并沒有相關的疫苗上市或者用于軍人免疫的特需疫苗。近年來我國地方和軍隊都有較大規(guī)模的腺病毒疫情爆發(fā),其中以HAdV-7引起的感染最為常見,造成的危害也最為嚴重,因此發(fā)展HAdV-7疫苗具有重要意義。中和抗體作為HAdV-7流行病學研究的重要研究對象,也是HAdV-7疫苗免疫效果評價的關鍵指標。傳統(tǒng)HAdV-7中和抗體的檢測方法是基于細胞病變法(CPE),該方法具有周期性長(4~8天),靈敏度低,穩(wěn)定性差等不足之處~([1])。本研究中建立了利用報告基因法定量檢測HAdV-7中和抗體的新方法。我們利用同源重組構建了E1區(qū)和E3區(qū)部分缺失,并在E1區(qū)缺失部位嵌入帶有熒光素酶表達框的pAd7-Luc重組質粒,轉染HEK293細胞,從而包裝出能夠表達熒光素酶報告基因的Ad7重組病毒(Ad7-Luc)�；贏d7-Luc重組病毒建立了報告基因檢測HAdV-7中和抗體的方法,并進行了方法學驗證。結果顯示:構建的Ad7-Luc重組病毒,病毒滴度可達4.85×10~8 IFU/mL。報告基因檢測法與傳統(tǒng)細胞病變效應(CPE)法檢測HAdV-7中和抗體具有良好的一致性(R=0.8612,P0.0001),批內和批間差異分別在10%和20%以內。與傳統(tǒng)的細胞病變方法相比,HAdV-7中和抗體報告基因檢測方法更加快速(1天)、靈敏、準確,適用于HAdV-7血清流行病學調查以及相關疫苗的中和抗體檢測。利用該方法我們共檢測了北京和泰州兩地375份健康成人血清樣本,結果顯示:北京和泰州兩地HAdV-7血清陽性率分別為56.47%(144/255)和57.50%(69/120),其中低滴度水平(12~200)陽性血清數分別占總陽性血清樣本的70.14%(101/144)和85.51%(59/69)。與實驗室前期HAdV-4和HAdV-5檢測數據進行統(tǒng)計分析發(fā)現兩地HAdV-7血清陽性率顯著低于HAdV-5(p0.001),而與HAdV-4無顯著性差異(p0.05);同時發(fā)現HAdV-7血清陽性率并不存在性別間差異,并隨著年齡的增長呈現逐漸上升的趨勢。接下來,進行了HAdV-7候選疫苗的免疫學評價研究,評價不同形式的HAdV-7活病毒疫苗的在不同動物上的免疫效果。首先以BALB/c,C57 BL/6和金黃地鼠作為動物模型,肌肉注射和腹腔注射活的HAdV-7,結果顯示:兩種免疫途徑均能檢測到較高水平HAdV-7中和抗體,中和抗體在免疫后4周達到峰值,隨后逐漸降低,但能長期維持一定的水平。然后以BALB/c小鼠作為動物模型,通過肌肉給藥研究疫苗的免疫劑量依賴關系以及細胞免疫反應。結果顯示:低劑量HAdV-7(1×10~5 IFU/只)能使50%的小鼠產生中和抗體,隨著免疫劑量的增加中和抗體水平顯著升高;利用流式細胞術檢測HAdV-7免疫14天后的小鼠脾臟細胞,結果顯示:只檢測到特異性CD4~+T細胞反應,未檢測到特異性CD8~+T細胞反應。最后,以恒河猴作為動物模型,通過肌肉注射活病毒和口服活病毒片劑的方式進行免疫,進行中和抗體和細胞免疫反應檢測(流式細胞術和ELISPOT)。結果顯示:肌肉免疫后能迅速激發(fā)體液免疫反應,中和抗體在14天左右達到峰值,隨后顯著降低但仍能長時間維持一定水平;口服給藥組并未產生中和抗體。細胞免疫反應方面,肌肉注射組在免疫后7天,特異性CD8~+T細胞反應(IFN-γ、TNF-α、IL-2和CD107a)和CD4~+T細胞反應(IFN-γ、IL-2和CD154)顯著上調,14天后顯著下降;口服免疫途徑并未檢測到特異性的細胞免疫反應。我們推測HAdV-7活疫苗口服片劑無法順利到達恒河猴的腸部釋放并感染黏膜上皮細胞,從而無法進一步刺激機體產生免疫反應。綜上所述,本研究建立的利用熒光素酶報告基因檢測HAdV-7中和抗體的方法具有快速、靈敏、準確等優(yōu)點,適用于HAdV-7血清流行病學調查以及相關疫苗研究的中和抗體檢測。HAdV-7候選疫苗的免疫學評價研究發(fā)現肌肉注射免疫方式能夠快速激發(fā)體液免疫反應和細胞免疫反應,然而口服活疫苗仍需進一步優(yōu)化和研究。
【學位單位】：軍事科學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

圖 1 1979-2016 年我國腺病毒疫情流行病學統(tǒng)計Figure 1 Epidemiological statistics of adenovirus outbreaks from 1979 to 2China中和抗體作為病原學流行病研究的重要指標，反應了人群中病毒感染水可以幫助了解各地腺病毒流行情況，有助于預測潛在的腺病毒疫情爆發(fā)。然目前國內外 7 型腺病毒血清中和抗體的研究卻鮮有報道，國內針對 7 型腺病群感染水平的調查和研究最早還要追溯到 20 世紀 90 年代[40,41]，最新的報道一篇，是 2018 年由廣州呼研所的陳凌教授和中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康院馮立強教授合作完成了湖南郴州地區(qū) 1302 份血清中和抗體的檢測，這些研中在我國南方部分地區(qū)，北部地區(qū)人群 7 型腺病毒感染情況仍然未知。目前檢測血清腺病毒中和抗體的方法有兩類：一種是細胞病變法，腺病抗體孵育后，觀察感染細胞產生的細胞病變效應（CPE）；另一種是報告基因血清中的中和抗體能夠抑制病毒感染從而降低報告基因的表達水平，檢測報因的表達水平，從而通過相應的抑制程度來確定中和抗體水平，常用的報告有β-半乳糖苷酶（LacZ）、綠色熒光蛋白（GFP）、分泌型堿性磷酸酶（S和熒光素酶（Luciferase）。傳統(tǒng)的 CPE 法周期長（4~8 天），主觀性強，靈

第 6 頁圖 1.1 Ad7-Luc 重組病毒構建流程圖Figure 1.1 Schematic diagram of Ad7-Luc recombinant virus construction1.1 材料與方法1.1.1 材料1.1.1.1 毒株、菌株、細胞和動物HAdV-7 毒株兩株：一株由本室保存（毒株待定），候選疫苗株由康希諾生

軍事科學院碩士學位論文1.2 結果1.2.1 HAdV-7 毒株的培養(yǎng)與鑒定首先確定了本室保存毒株具體種類，根據 HAdV-7 毒株（AY594255）基因組序設計了 5 對引物，進行 PCR 擴增與測序（圖 1果分析顯示：5 段序列與 HAdV-7-GZ08（GQ478341）的匹配程度最高以上，由此我們可以確定該毒株為我國廣州地區(qū)流行并分離鑒定的 Ad毒株。
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本文編號：2892974