本文關(guān)鍵詞：干擾素γ對(duì)肥大細(xì)胞表達(dá)組織蛋白酶S的影響

  更多相關(guān)文章： P815細(xì)胞系 小鼠骨髓源性肥大細(xì)胞 IFN-γ 組織蛋白酶S

【摘要】：研究背景組織蛋白酶S (cathepsin S, CTSS)是木瓜蛋白酶超家族的一種半胱氨酸蛋白酶,對(duì)多種蛋白具有催化水解活性。組織蛋白酶S有許多獨(dú)特的功能,如參與MHC Ⅱ抗原提呈,特別是恒定鏈的降解。與其他類型半胱氨酸組織蛋白酶相比,組織蛋白酶S僅在特定組織表達(dá),且在中性PH環(huán)境下仍具有活性。在多種抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells,APCs)中均檢測(cè)到組織蛋白酶S的表達(dá),如B細(xì)胞、樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。組織蛋白酶S在多種生理及病理過程中均發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)功能,其過量或不適當(dāng)激活與多種疾病的病理過程密切相關(guān),如心血管疾病、哮喘、腫瘤、神經(jīng)痛及多種自身免疫性疾病等。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)患者血清及滑膜液中的組織蛋白酶S較正常人均有顯著增加,但其濃度與疾病嚴(yán)重性是否相關(guān)仍存在一定的爭(zhēng)議。組織蛋白酶S主要由類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)的滑膜巨噬細(xì)胞表達(dá),另有報(bào)道稱軟骨細(xì)胞也可能是組織蛋白酶S來源之一。組織蛋白酶S獨(dú)特的組織分布局限性使其成為相關(guān)疾病理想的靶向治療目標(biāo)。研究者認(rèn)為這種選擇性抑制治療可將潛在副作用降至最低。目前有一種用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的組織蛋白酶S抑制劑藥物在進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗(yàn);近期研究證實(shí)組織蛋白酶S抑制劑在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)狼瘡腎炎有一定的治療作用。肥大細(xì)胞(mast cells,MCs)是體內(nèi)重要的免疫及炎癥效應(yīng)細(xì)胞。既往研究多集中在肥大細(xì)胞參與速發(fā)型過敏反應(yīng),2002年Lee等人研究發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞在慢性炎癥中也發(fā)揮著重要作用,尤其是自身免疫性疾病。肥大細(xì)胞活化后主要通過三種途徑表達(dá)介質(zhì)：一,細(xì)胞內(nèi)顆粒含有大量預(yù)形成的介質(zhì)(如組胺、蛋白酶、蛋白多糖、肝素),在細(xì)胞活化脫顆粒時(shí)快速釋放；二,某些活化通路可以誘導(dǎo)脂質(zhì)衍生的介質(zhì)(如白三烯、前列腺素)釋放；三,細(xì)胞活化誘導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)某些細(xì)胞因子、趨化因子及生長因子的從頭合成,并在活化后幾小時(shí)內(nèi)釋放。病理?xiàng)l件下,肥大細(xì)胞可以被多種炎性因子活化,參與多種自身免疫性疾病的發(fā)病過程。Mallen-St Clair J等人在原代培養(yǎng)的小鼠骨髓源性肥大細(xì)胞(bone marrow mast cells,BMMCs)中檢測(cè)到組織蛋白酶S的mRNA表達(dá),并且利用25I]-JPM-乙基酯([125I]-JPM-ethyl ester)示蹤檢測(cè)到有活性的組織蛋白酶S,證明肥大細(xì)胞也是組織蛋白酶S的來源之一。干擾素Y(interferon-γ,IFN-γ)是標(biāo)志性的Thl型細(xì)胞因子,可以促進(jìn)CD4+Th細(xì)胞向Thl細(xì)胞的分化,并刺激白細(xì)胞介素2(interleukin 2, IL-2)、白細(xì)胞介素12(interleukin 12, IL-12)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)等細(xì)胞因子的上調(diào)。自身免疫性疾病導(dǎo)致體內(nèi)免疫紊亂時(shí),自身反應(yīng)性T細(xì)胞的過度增殖導(dǎo)致Thl/Th2細(xì)胞的失衡,血清IFN-γ水平升高,機(jī)體出現(xiàn)過度炎癥反應(yīng)。IFN-γ可通過激活Janus激酶／信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)通路啟動(dòng)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄影響細(xì)胞功能,上調(diào)不同細(xì)胞中組織蛋白酶S的表達(dá)。用IFN-γ處理巨噬細(xì)胞后,組織蛋白酶S表達(dá)增加,且這種促進(jìn)作用可被白細(xì)胞介素10 (interleukin 10,IL-10)阻斷。用IFN--γ處理小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞后,組織蛋白酶S的表達(dá)量沒有明顯變化,但活性升高。目的目前仍缺乏炎性介質(zhì)IFN-γ對(duì)肥大細(xì)胞表達(dá)組織蛋白酶S的影響方面的研究。因此,本實(shí)驗(yàn)擬利用IFN-γ刺激小鼠肥大細(xì)胞系P815細(xì)胞及原代培養(yǎng)的小鼠骨髓源性肥大細(xì)胞,觀察其對(duì)肥大細(xì)胞表達(dá)組織蛋白酶S的影響。材料和方法1.材料P815小鼠肥大細(xì)胞系購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫,原代培養(yǎng)小鼠骨髓源性肥大細(xì)胞來自5周齡C57BL/6雄性小鼠,實(shí)驗(yàn)小鼠購自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。2.P815小鼠肥大細(xì)胞系的培養(yǎng)P815細(xì)胞用含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、1%青-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、5%C02條件下培養(yǎng)。3.小鼠骨髓源性肥大細(xì)胞的培養(yǎng)選取5周齡C57BL/6雄性小鼠,頸椎脫臼法處死后,分離并剪斷股骨、脛骨兩端,置于含RPMI 1640的培養(yǎng)平皿中,用注射器抽取培養(yǎng)基沖洗骨髓腔至顏色發(fā)白,后接種于RPMI1640完全培養(yǎng)基(RPMI 1640含2.5 mmol/L L-谷氨酰胺,10%FBS,1%青-鏈霉素),再加入重組小鼠白細(xì)胞介素3(interleukin 3,IL-3),使其終濃度為lOng/ml,于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。每三天換一次液,兩周后追加重組小鼠干細(xì)胞生長因子(stem cell factor,SCF),使其終濃度為20ng/ml,根據(jù)細(xì)胞生長情況,每五至七天換一次液。4.骨髓源性肥大細(xì)胞的甲苯胺藍(lán)染色收集培養(yǎng)8周的骨髓源性肥大細(xì)胞,1500r/min離心4min,PBS洗滌2次,細(xì)胞涂片,自然風(fēng)干,1%甲苯胺藍(lán)染色1min,迅速用去離子水漂洗1次,顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。5.P815細(xì)胞及骨髓源性肥大細(xì)胞的刺激將處于對(duì)數(shù)生長期的P815細(xì)胞用不含F(xiàn)BS的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2條件下饑餓培養(yǎng)6 h。將饑餓處理后的P815細(xì)胞和培養(yǎng)8周的BMMCs調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/ml后,接種于6孔板中。分別加入10、25、50ng/ml的IFN-y各培養(yǎng)24 h,以未加刺激的細(xì)胞作為陰性對(duì)照組,收集細(xì)胞及上清液。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用25、50ng/ml IFN-γ刺激對(duì)P815細(xì)胞及BMMCs表達(dá)CTSS的影響相似,故每孔加入25 ng/ml IFN-γ刺激細(xì)胞,P815細(xì)胞培養(yǎng)6、12、18、24、48、72 h；由于BMMCs培養(yǎng)周期長且細(xì)胞數(shù)量有限,故BMMCs僅選取預(yù)實(shí)驗(yàn)中探索到的3個(gè)有意義時(shí)間點(diǎn)12、24、48 h進(jìn)行培養(yǎng),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均以未加刺激的細(xì)胞作為陰性對(duì)照組,收集細(xì)胞及上清液。6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)P815細(xì)胞及BMMCs CTSS mRNA的水平將以上實(shí)驗(yàn)中收集的P815細(xì)胞和BMMCs,按照說明書操作用RNAiso Plus提取細(xì)胞總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280的比值在1.8-2.0之間。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的總RNA的完整性。按照TaKaRa公司PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書進(jìn)行cDNA合成。按照TaKaRa公司SYBR(?)remix Ex TaqTM試劑盒說明書在LightCycler(?)480型熒光定量PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行定量檢測(cè)cDNA。PCR反應(yīng)條件：95℃變性30s、95℃5s、60℃30s,循環(huán)40次。95℃5 s,60℃融解60s,50℃降溫30 s。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。融解曲線分析表明PCR反應(yīng)產(chǎn)物為單獨(dú)的雙鏈DNA。每個(gè)樣品目的基因擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)(threshold cycle, Ct)都依據(jù)內(nèi)參進(jìn)行校正,得出ACt(Ct目的基因-Ct內(nèi)參)。目的基因表達(dá)差異=2-ΔΔCt(ΔΔCt=ΔCt處理樣品-ACt未處理樣品)。7. ELISA檢測(cè)P815細(xì)胞及BMMCs上清液中CTSS蛋白的水平以上實(shí)驗(yàn)中收集的上清液按照小鼠CTSS ELISA試劑盒說明書檢測(cè)CTSS蛋白濃度。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SPSS20.0軟件處理,兩個(gè)樣本均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn),多個(gè)樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析,均數(shù)間兩兩比較,方差齊性時(shí)用LSD法,方差不齊時(shí)用Dunnett's法。P0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.原代培養(yǎng)8周骨髓源性肥大細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察以及骨髓源性肥大細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色光鏡下的BMMCs培養(yǎng)24 h后開始出現(xiàn)不規(guī)則形狀的貼壁細(xì)胞,視野中可見大小不一的懸浮細(xì)胞。隨著換液次數(shù)的增加,貼壁細(xì)胞數(shù)量減少,培養(yǎng)基中逐漸僅剩大小形態(tài)均一的懸浮細(xì)胞。甲苯胺藍(lán)染色液呈藍(lán)色,由于肥大細(xì)胞堿性顆粒的異染性,其所顯示的顆粒顏色與染料顏色存在差異,肥大細(xì)胞顆粒被染成紫紅色,而各種細(xì)胞核若被著色則呈現(xiàn)藍(lán)色。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)甲苯胺藍(lán)染色后,可見細(xì)胞胞漿中的顆粒被染成紫紅色。2.P815細(xì)胞和BMMCs經(jīng)不同濃度的IFN-γ刺激后CTSS的mRNA及蛋白表達(dá)水平實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)所收集細(xì)胞的CTSS mRNA水平,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,IFN-7刺激P815細(xì)胞及BMMCs后,CTSS mRNA的表達(dá)量均升高(P0.05),且這種刺激作用隨IFN-y濃度的升高而增加(P0.05)。ELISA檢測(cè)所收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液的CTSS蛋白水平,結(jié)果顯示,除10 ng/ml IFN-y刺激P815細(xì)胞后上清液中CTSS濃度與對(duì)照組相比無差異(P0.05),其余各組Ⅱ EN-γ刺激P815細(xì)胞及BMMCs后上清液中CTSS濃度均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且這種刺激作用隨IFN-7濃度的升高而增加。但25 ng/ml與50ng/ml IFN-γ刺激P815細(xì)胞相比,上清液中CTSS濃度無差異(P0.05)。3.25ng/ml的IFN-y刺激P815細(xì)胞和BMMCs作用不同時(shí)間后CTSS的mRNA及蛋白表達(dá)水平實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)所收集細(xì)胞的CTSS mRNA水平,結(jié)果顯示,P815細(xì)胞經(jīng)25ng/ml的IFN-y刺激12 h后,CTSS的mRNA表達(dá)量增加,與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),此后隨時(shí)間延長,mRNA表達(dá)量逐漸升高,24 h時(shí)達(dá)到頂峰后開始下降,72 h時(shí)與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。BMMCs經(jīng)25 ng/ml IFN-y刺激12h后,CTSS mRNA表達(dá)量增加,與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),24 h時(shí)達(dá)到頂峰,48 h時(shí)下降。ELISA檢測(cè)所收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液的CTSS蛋白水平,結(jié)果顯示,未經(jīng)IFN-γ刺激的P815細(xì)胞及BMMCs上清液中均含有CTSS。P815細(xì)胞經(jīng)25ng/ml的IFN-γ刺激12h后,上清液中CTSS濃度增加,與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),此后濃度呈上升趨勢(shì),48h時(shí)達(dá)到頂峰后下降,但6h、18h和72h刺激組與對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。BMMCs經(jīng)25 ng/ml IFN-γ刺激12h后,上清液中CTSS濃度增加,與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),濃度于48h時(shí)達(dá)到頂峰。結(jié)論IFN-γ可增加肥大細(xì)胞CTSS的mRNA和蛋白水平,并具有一定的時(shí)間、劑量依賴關(guān)系。
【關(guān)鍵詞】：P815細(xì)胞系 小鼠骨髓源性肥大細(xì)胞 IFN-γ 組織蛋白酶S
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-32
• 1. 組織蛋白酶S18-24
• 2. 肥大細(xì)胞24-29
• 3. IFN-γ29-32
• 材料與方法32-46
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料32-34
• 1.2 主要試劑與配制34-38
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法38-46
• 結(jié)果46-54
• 1. 原代培養(yǎng)8周BMMCs形態(tài)學(xué)觀察以及BMMCs甲苯胺藍(lán)染色46-47
• 2. 不同濃度及IFN-γ對(duì)P815細(xì)胞及BMMCs的CTSS MRNA表達(dá)的影響47-48
• 3. 不同濃度IFN-γ對(duì)P815細(xì)胞及BMMCs上清液中CTSS濃度的影響48-50
• 4. 25NG/ML的IFN-γ作用不同時(shí)間對(duì)P815細(xì)胞及BMMCs的CTSS MRNA表達(dá)的影響50-52
• 5. 25NG/ML的IFN-γ作用不同時(shí)間對(duì)P815細(xì)胞及BMMCs上清液中CTSS濃度的影響52-54
• 討論54-58
• 全文小結(jié)58-59
• 參考文獻(xiàn)59-71
• 縮略語詞匯表71-73
• 攻讀學(xué)位期間成果73-74
• 致謝74-76

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5 楊遠(yuǎn)萍;家蠶組織蛋白酶基因家族結(jié)構(gòu)分析及功能初探[D];西南大學(xué);2006年

6 胡鑫;組織蛋白酶C在鼠、人組織中的表達(dá)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

7 劉玉欣;刺參（Stichopus japonicus）體壁組織蛋白酶L的組織化學(xué)定位研究[D];大連工業(yè)大學(xué);2014年

8 謝志宙;旋毛蟲組織蛋白酶B基因家族的克隆、表達(dá)及鑒定[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

9 申潞璐;胰島素生長因子及組織蛋白酶B在慢性阻塞性肺疾病患者血液中的表達(dá)及臨床意義[D];山西醫(yī)科大學(xué);2013年

10 常獻(xiàn)娜;刺參（Stichopus japonicus）體壁組織蛋白酶L樣蛋白酶的免疫組化研究[D];大連工業(yè)大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：609596