本文關(guān)鍵詞：pH對(duì)小鼠肝炎病毒S蛋白構(gòu)象變化機(jī)制的研究

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【摘要】：冠狀病毒是是已知RNA病毒中基因組最大的包膜病毒,在人類、其它哺乳動(dòng)物類以及鳥(niǎo)類中廣泛傳播；近十幾年來(lái),冠狀病毒已經(jīng)引起兩次世界范圍內(nèi)的流行：SARS-CoV和MERS-CoV,死亡率較高,嚴(yán)重威脅人類健康及生命安全。冠狀病毒的感染是由刺突蛋白S與受體相互作用介導(dǎo)的,而S蛋白是宿主中和性抗體的主要靶分子,由S1亞基和S2亞基構(gòu)成,S1負(fù)責(zé)受體的結(jié)合,S2亞基介導(dǎo)病毒包膜與細(xì)胞膜之間的融合；一般認(rèn)為,天然的S蛋白處于一個(gè)亞穩(wěn)定狀態(tài),當(dāng)S1與受體結(jié)合之后會(huì)發(fā)生一系列構(gòu)象變化,然后S1解離,S2亞基上的膜融合肽暴露插入到細(xì)胞膜,隨后S2亞基上的兩個(gè)7肽重復(fù)序列形成六螺旋束結(jié)構(gòu),最終導(dǎo)致膜融合。S2發(fā)生的一系列構(gòu)象變化的機(jī)制相對(duì)清楚,但S1跟受體結(jié)合后是怎樣發(fā)生構(gòu)象變化以及構(gòu)象變化的信號(hào)是怎樣傳遞下去并最終介導(dǎo)膜融合的機(jī)制是不清楚的。前期的研究表明小鼠肝炎病毒中在pH8.0、沒(méi)有受體誘導(dǎo)的條件下,S蛋白發(fā)生構(gòu)象變化并高效介導(dǎo)非受體依賴的細(xì)胞膜融合(receptor independent syncytia, RIS),并且pH8.0誘導(dǎo)的S蛋白構(gòu)象變化跟受體誘導(dǎo)的S蛋白構(gòu)象變化非常類似。因此,這正好為我們研究受體介導(dǎo)的S蛋白發(fā)生構(gòu)象變化提供一個(gè)相對(duì)簡(jiǎn)單的研究模型,為進(jìn)一步闡明冠狀病毒感染機(jī)制提供了便利的條件。本課題旨在研究沒(méi)有受體的條件下,pH8.0誘導(dǎo)S蛋白發(fā)生的RIS的具體的分子機(jī)制。文獻(xiàn)報(bào)道,組氨酸的pKa值接近中性,是唯一一個(gè)pKa值接近中性的氨基酸,在流感病毒中已經(jīng)證明組氨酸的質(zhì)子化可以引發(fā)HA蛋白的構(gòu)象變化。因此我們對(duì)MHV A59中的所有組氨酸進(jìn)行了突變,然后研究突變體在pH8.0時(shí)是否還能夠介導(dǎo)RIS,以此來(lái)判斷該組氨酸在pH誘導(dǎo)的構(gòu)象變化中的作用。我們發(fā)現(xiàn)S蛋白中179、209、441、643、759位置的組氨酸對(duì)pH誘導(dǎo)S蛋白R(shí)IS的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,然后我們進(jìn)一步研究組氨酸的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)在pH誘導(dǎo)的S蛋白介導(dǎo)的RIS中的作用,我們將179、209、441、643、759位置的組氨酸突變成苯丙氨酸,發(fā)現(xiàn)759位置的芳香環(huán)在S蛋白介導(dǎo)的RIS中起著重要作用,但由于苯丙氨酸不受pH影響的特性,我們排除759位置的組氨酸作為pH sensor的可能。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)MHV A59 S蛋白179、209、441、643位置的組氨酸在pH8.0誘導(dǎo)的RIS中起著關(guān)鍵作用,是主要pH sensor,同時(shí)組氨酸芳香環(huán)在pH誘導(dǎo)的S蛋白介導(dǎo)的RIS過(guò)程中也發(fā)揮了一定的作用。
【關(guān)鍵詞】：冠狀病毒 小鼠肝炎病毒 刺突蛋白 癌胚抗原相關(guān)黏附分子
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R373
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-9
• 第一章 前言9-20
• 1.1 冠狀病毒簡(jiǎn)介9-14
• 1.1.1 冠狀病毒的分類9-10
• 1.1.2 冠狀病毒的結(jié)構(gòu)10-12
• 1.1.3 冠狀病毒的生命周期12-13
• 1.1.4 冠狀病毒的流行病學(xué)特征及危害13-14
• 1.2 冠狀病毒S蛋白的研究進(jìn)展14-20
• 1.2.1 S蛋白的結(jié)構(gòu)特征及功能14-16
• 1.2.2 S蛋白與受體相互作用關(guān)系的研究進(jìn)展16-17
• 1.2.3 S蛋白誘導(dǎo)膜融合機(jī)制的研究進(jìn)展17-19
• 1.2.4 結(jié)語(yǔ)19-20
• 第二章 pH對(duì)小鼠肝炎病毒S蛋白構(gòu)象變化的機(jī)制的研究20-52
• 2.1 引言20-23
• 2.2 材料與方法23-40
• 2.2.1 主要試劑及培養(yǎng)基23
• 2.2.2 主要儀器設(shè)備23-24
• 2.2.3 主要耗材24
• 2.2.4 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞24
• 2.2.5 常用溶液的配方及配制24-25
• 2.2.6 突變質(zhì)粒的構(gòu)建25-29
• 2.2.7 受體蛋白的真核表達(dá)29-35
• 2.2.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染35
• 2.2.9 western-blot檢測(cè)冠狀病毒S蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)35-36
• 2.2.10 流式細(xì)胞儀檢測(cè)冠狀病毒S蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)36-37
• 2.2.11 MHV假病毒的包裝及假病毒顆粒中S蛋白的檢測(cè)37
• 2.2.12 受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)37-38
• 2.2.13 細(xì)胞融合的熒光定量分析38
• 2.2.14 MHV重組病毒的拯救38-40
• 2.3 結(jié)果與分析40-50
• 2.3.1 MHV A59野生型S蛋白在有受體或pH8.0沒(méi)有受體存在的條件下均能發(fā)生構(gòu)象變化40-42
• 2.3.2 組氨酸突變的選擇42-43
• 2.3.3 組氨酸突變對(duì)S蛋白表達(dá)的影響43-44
• 2.3.4 組氨酸突變對(duì)S蛋白構(gòu)象及功能的影響44-45
• 2.3.5 組氨酸突變對(duì)受體介導(dǎo)的病毒的入侵的影響45-46
• 2.3.6 組氨酸突變對(duì)pH介導(dǎo)的膜融合的影響46-48
• 2.3.7 組氨酸中芳香環(huán)的結(jié)構(gòu)對(duì)pH介導(dǎo)的細(xì)胞融合情況的影響48-50
• 2.4 討論50-52
• 第三章 全文總結(jié)52-53
• 3.1 結(jié)論52
• 3.2 研究中的不足及進(jìn)一步待解決的問(wèn)題52-53
• 參考文獻(xiàn)53-58
• 附錄一 MHV S蛋白基因序列58-60
• 附錄二 英文縮寫(xiě)詞對(duì)照表縮略語(yǔ)60-61
• 致謝61-63
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷及所發(fā)表的文章63

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