發(fā)布時(shí)間：2017-08-01 00:31

  本文關(guān)鍵詞：TK1和TIMP1基因共表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大鼠血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)

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【摘要】：目的構(gòu)建含人組織激肽釋放酶1(hTK1)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物(TIMP1)基因的重組腺病毒載體,并觀察其在大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)中的表達(dá)。方法選擇相對(duì)應(yīng)酶切位點(diǎn),酶切含人TIMP1基因片段的原始質(zhì)粒和腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC316,經(jīng)連接、熱激、轉(zhuǎn)化等亞克隆而構(gòu)建成重組穿梭質(zhì)粒。之后,應(yīng)用限制性內(nèi)切酶BglⅡ/SalⅠ,酶切含啟動(dòng)子和hTIMP1基因片段,再通過回收片段以及連接、熱激等步驟亞克隆至pDC316-hTK1載體中,構(gòu)建含雙基因(hTK1和hTIMP1)的重組病毒穿梭質(zhì)粒。利用AdMax腺病毒Cre/loxP重組酶系統(tǒng),將該質(zhì)粒和骨架病毒質(zhì)粒于293A細(xì)胞中同源重組包裝產(chǎn)生雙基因的重組腺病毒載體。采用Western blot測定在VSMCs中的表達(dá)。結(jié)果經(jīng)PCR、雙酶切和測序證實(shí),重組病毒穿梭質(zhì)粒pDC316-hTIMP1-EGFP和pDC316-hTK1-hTIMP1構(gòu)建正確。在293A細(xì)胞里成功包裝產(chǎn)生含雙基因的重組腺病毒載體Ad5-hTK1-hTIMP1感染VSMCs后,hTK1和hTIMP1蛋白呈獨(dú)立高表達(dá),表達(dá)水平呈濃度依賴性增加。結(jié)論首次成功構(gòu)建并包裝了含雙基因(hTK1和hTIMP1)的重組腺病毒載體,目的蛋白在VSMCs中呈現(xiàn)獨(dú)立高表達(dá),為血管重構(gòu)性疾病的多個(gè)功能基因治療奠定初步實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)
【作者單位】： 福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院干部二科;福建省立醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究室;福建省臨床老年病研究所;
【關(guān)鍵詞】： 組織激肽釋放酶基因 基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物基因 重組腺病毒載體 血管重構(gòu)
【基金】：福建省自然科學(xué)基金(2011J01134,2013J01273)
【分類號(hào)】：R329
【正文快照】： iflLH'平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)被、iX'移以及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)改變是血管損傷后冉狹窄、高血壓、動(dòng)n, ,,AW A恤n;3-脈粥樣硬化核管重構(gòu)的重要病理過程。mm善或逆轉(zhuǎn)i:述病理過程是近年來15方治血管重塑的基因治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。

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本文編號(hào)：601823