本文關(guān)鍵詞：miR-144對樹突狀細(xì)胞免疫學(xué)功能的影響及作用機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： microRNA miR-144 DCs NF-kB RANKL 細(xì)胞因子 Th17

【摘要】：DCs是參與機(jī)體內(nèi)抗原加工處理及遞呈的重要免疫細(xì)胞,是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵,在啟動特異性免疫應(yīng)答及誘導(dǎo)、維持免疫耐受方面具有重要作用。移植免疫學(xué)研究證實,DCs既可以分泌促炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1促進(jìn)自身活化提升遞呈抗原能力,又可以通過促炎性因子刺激T細(xì)胞分化和增殖,啟動免疫應(yīng)答反應(yīng)。另一方面,越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)體內(nèi)存在一種負(fù)向調(diào)控的DC亞群—耐受型DCs,Tol DCs可以分泌抗炎性細(xì)胞因子IL-10或抑制性分子ILT-2、ILT-4、HLA-G等負(fù)向調(diào)控T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng),誘導(dǎo)并維持免疫耐受的產(chǎn)生。通過干預(yù)DCs的功能來調(diào)控機(jī)體內(nèi)免疫狀態(tài),對移植排斥反應(yīng)、自身免疫性疾病、腫瘤的防治具有重要的現(xiàn)實意義�；贒Cs在移植免疫中的特殊地位,對DCs分化過程中重要調(diào)節(jié)分子的研究有助于探索移植免疫排斥、自身免疫性疾病、腫瘤的發(fā)生中的免疫應(yīng)答產(chǎn)生及調(diào)控機(jī)制。mi RNAs是一類高度保守、廣泛表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)的非編碼小分子RNA,約22~24nt,可通過結(jié)合目的基因的3′非翻譯區(qū)抑制其翻譯從而發(fā)揮免疫調(diào)控作用。近年來,mi RNAs對機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)控作用研究已受到眾多研究者的廣泛關(guān)注。在免疫細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn),mi RNAs在T、B淋巴細(xì)胞的活化、增殖中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。但是,在mi RNAs對DCs分化的研究較少。本研究中,我們分析實驗室前期工作中已有的關(guān)于DCs成熟過程中mi RNAs差異性表達(dá)的芯片數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)mi R-144在成熟后的DCs中出現(xiàn)顯著下調(diào),提示在DCs成熟過程中mi R-144可能是一個重要的負(fù)性調(diào)控因子。因此,本論文研究目的是為了探討mi R-144對DCs免疫學(xué)功能的影響及其具體作用機(jī)制,為移植排斥的防治提出新的途徑和策略,為mi RNAs在移植排斥反應(yīng)防治上提供了理論基礎(chǔ)及應(yīng)用的可能性。研究共分三個部分:(1)mi R-144在樹突狀細(xì)胞成熟前后的差異性表達(dá);(2)mi R-144對樹突狀細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響及機(jī)制研究;(3)mi R-144在樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)Th17免疫反應(yīng)中的作用研究。一、mi R-144在樹突狀細(xì)胞成熟前后的差異性表達(dá)目的:應(yīng)用軟件包分析DCs成熟過程中mi R-144差異性表達(dá)的mi RNAs芯片數(shù)據(jù)并進(jìn)行驗證。方法:從C57BL/6小鼠四肢骨分離的骨髓細(xì)胞細(xì)胞懸浮于含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中。調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×109/L接種于1%明膠包被的6孔板內(nèi)并加入10ng/ml GM-CSF及10ng/ml IL-4,置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48小時后小心吸去懸浮細(xì)胞及培養(yǎng)液(去除粒細(xì)胞),保留貼壁細(xì)胞;繼續(xù)培養(yǎng)至第5天半量換液,至第七天吹打收集細(xì)胞。工作濃度1000ng/ml的LPS刺激后,8小時收集細(xì)胞。培養(yǎng)的細(xì)胞于倒置顯微鏡下進(jìn)行一般形態(tài)學(xué)觀察。應(yīng)用軟件包分析實驗室已有的關(guān)于mi RNAs在DCs成熟過程中差異表達(dá)的micro RNAs芯片檢測數(shù)據(jù)。收集LPS刺激誘導(dǎo)的DCs與未刺激的DCs,抽提細(xì)胞總RNA。通過RT-PCR技術(shù)檢測DCs成熟前后mi R-144表達(dá)量的變化,對比micro RNAs芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行驗證。結(jié)果:從micro RNAs芯片檢測數(shù)據(jù)中篩選出DCs成熟分化過程中mi R-144出現(xiàn)差異性表達(dá),通過RTPCR進(jìn)一步檢測表明mi R-144在小鼠成熟后的DCs中出現(xiàn)顯著性下調(diào)(P0.01)。結(jié)論:mi R-144在樹突狀細(xì)胞成熟前后呈差異性表達(dá)。二、mi R-144對樹突狀細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響及機(jī)制研究目的:探討mi R-144在DCs分泌細(xì)胞因子中的影響及其作用機(jī)制。方法:將mi R-144 inhibitors和mimics轉(zhuǎn)染至DCs,轉(zhuǎn)染48小時后收集細(xì)胞,用1000ng/ml的LPS刺激成熟。通過RT-PCR檢測LPS刺激成熟后的DCs分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23表達(dá)量的變化,ELISA檢測RANKL蛋白定量表達(dá)水平。Western blot檢測LPS刺激成熟后的DCs過程相關(guān)的信號通路活化情況。根據(jù)生物學(xué)信息相關(guān)軟件和數(shù)據(jù)庫預(yù)測mi R-144可能存在的潛在作用靶點,并通過熒光素酶報告檢測驗證mi R-144與RANKL之間存在靶向關(guān)系。構(gòu)建si RANKL和穩(wěn)定過表達(dá)RANKL的DC2.4細(xì)胞系,進(jìn)一步驗證mi R-144可以通過靶向作用調(diào)控DCs分泌細(xì)胞因子。結(jié)果:轉(zhuǎn)染mi R-144 inhibitor可顯著上調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23表達(dá),轉(zhuǎn)染mi R-144 mimics可顯著下調(diào)上述細(xì)胞因子表達(dá)。且高表達(dá)mi R-144可以抑制p65活化。通過KEGG及Target Scan軟件在TLR4/NF-κB信號通路中mi R-144有一個靶基因NF-κB受體活化因子配體(RANKL),存在兩個保守的結(jié)合位點。熒光素酶報告研究顯示:mi R-144 inhibitor可以上調(diào)熒光素酶活性,而mi R-144 mimics則下調(diào)熒光素酶活性。應(yīng)用點突變證實mi R-144的結(jié)合位點為RANKL 3′非翻譯區(qū)679-685處,調(diào)控作用是通過抑制其m RNA翻譯來實現(xiàn)的。mi R-144可以通過靶向RANKL影響DCs產(chǎn)生細(xì)胞因子。結(jié)論:mi R-144可以通過靶向RANKL影響DCs的免疫學(xué)功能。三、mi R-144在樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)Th17免疫反應(yīng)中的作用研究目的:建立穩(wěn)定的CD4+T細(xì)胞與DCs共培養(yǎng)誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)體系,探討mi R-144在DCs誘導(dǎo)Th17分化及分泌細(xì)胞因子中的作用。方法:將從C57BL/6小鼠脾細(xì)胞分選的CD4+T細(xì)胞與轉(zhuǎn)染mi R-144 inhibitors、mi R-144 mimics的DCs共培養(yǎng),并在細(xì)胞混懸液中加入適量的游離抗CD3、TGF-β1、IL-6、IL-1β、抗IL-2、抗IFN-γ、抗IL-4、IL-23。于5%CO2孵箱中培養(yǎng)4天后,加入PMA、Ionomycin、Brefeldin A繼續(xù)刺激5-12小時,即可獲得Th17細(xì)胞。通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測共培養(yǎng)體系中誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞比例,ELISA檢測共培養(yǎng)上清液中IL-17表達(dá)。結(jié)果:與對照組相比,轉(zhuǎn)染mi R-144mimics可以抑制CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)化,并抑制IL-17分泌;轉(zhuǎn)染mi R-144 inhibitors則可促使CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)化,上調(diào)IL-17表達(dá)。結(jié)論:mi R-144可通過靶向作用影響DCs誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞的分化并影響IL-17的分泌。
【關(guān)鍵詞】：microRNA miR-144 DCs NF-kB RANKL 細(xì)胞因子 Th17
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 縮略詞表11-12
• 前言12-14
• 第一部分miR-144在樹突狀細(xì)胞成熟前后的差異性表達(dá)及驗證14-22
• 一、材料與方法14-18
• 二、結(jié)果18-20
• 三、討論20-22
• 第二部分miR-144對樹突狀細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響及機(jī)制研究22-34
• 一、材料與方法22-27
• 二、結(jié)果27-32
• 三、討論32-34
• 第三部分miR-144在樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)中的作用研究34-40
• 一、材料與方法34-36
• 二、結(jié)果36-38
• 三、討論38-40
• 參考文獻(xiàn)40-43
• 文獻(xiàn)綜述43-59
• 參考文獻(xiàn)52-59
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況59-60
• 致謝60

【參考文獻(xiàn)】

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1 司中洲;李亭;李杰群;齊海智;謝續(xù)標(biāo);;白細(xì)胞介素-17與Th17細(xì)胞在小鼠腎移植急性排斥反應(yīng)中的表達(dá)及意義[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2011年08期

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本文編號：601799