本文關(guān)鍵詞：腸道病毒71型2A蛋白在病毒復(fù)制能力與毒力中的作用

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【摘要】：腸道病毒71型(Enterovirus 71, EV71)是手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)的主要病原體之一,屬于小RNA病毒(Picornaviridae)科,腸道病毒(Enterovirus) A屬(species A),具有嗜神經(jīng)性,主要感染嬰幼兒和五歲以下兒童。EV71感染造成的HFMD臨床癥狀呈現(xiàn)多樣化,一般僅表現(xiàn)為患者手、足、口部位的皮疹和皰疹等,為自限性疾病,但嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)并發(fā)癥,包括脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹、無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎等,甚至造成死亡。EV71全長(zhǎng)基因組約為7.4 kb,僅有一個(gè)開(kāi)放閱讀框架(open reading fragment, ORF),兩端分別為3'UTR和5'UTR區(qū)。目前,EV71的致病機(jī)制仍不明確,我們之前的研究表明EV71的復(fù)制能力與病毒毒力相關(guān)。本研究利用反向遺傳技術(shù),將EV71山東分離株SDLY107株(分離自死亡患兒)與SDLY1株(分離自輕癥HFMD患兒)的2A蛋白進(jìn)行置換后,構(gòu)建了具有感染性的嵌合病毒,研究2A蛋白在病毒復(fù)制能力和毒力中發(fā)揮的作用。目的：1.對(duì)EV71不同毒力表型株(SDLY 107株和SDLY1株)的2A進(jìn)行置換,構(gòu)建出EV71嵌合體的感染性克隆cDNA,從而拯救出嵌合病毒株SDLY107-2A-1;2.研究原毒株和嵌合毒株在體外和體內(nèi)復(fù)制能力的差異,以期得到2A對(duì)病毒復(fù)制能力的影響；3.通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究原毒株和嵌合毒株對(duì)細(xì)胞和乳鼠器官損傷作用,以期得到2A對(duì)病毒毒力的影響。方法：1.利用重疊PCR的方法,設(shè)計(jì)合適的引物,獲得SDLY1株的2A基因片段,雙酶切后置換到含有SDLY 107株全長(zhǎng)的質(zhì)粒pMD-19T中,利用體外轉(zhuǎn)錄獲得感染性RNA后,轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞,觀察到明顯細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE)后,盲傳三代,拯救出嵌合病毒SDLY 107-2A-1株；2.用EV71通用引物EV71-S和EV71-A擴(kuò)增嵌合毒株的VP1片段,凝膠電泳進(jìn)行鑒定；以SDLY 107株免疫ICR小鼠獲得的抗血清作為一抗,利用間接免疫熒光和免疫印跡等方法對(duì)嵌合病毒株進(jìn)行鑒定,測(cè)序驗(yàn)證后,用50%中點(diǎn)法和空斑試驗(yàn)測(cè)定病毒滴度；3.將強(qiáng)毒株SDLY 107株、弱毒株SDLY1株及嵌合毒株SDLY 107-2A-1株分別感染細(xì)胞48 h后,利用LDH試驗(yàn)和CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)不同毒株感染Vero細(xì)胞和RD細(xì)胞造成的細(xì)胞損傷差異；4.將強(qiáng)毒株SDLY 107株、弱毒株SDLY1株及嵌合毒株SDLY 107-2A-1株分別感染細(xì)胞,在不同溫度下(37℃和39℃)進(jìn)行培養(yǎng),每12h取一次上清,連續(xù)取樣5 d,樣本統(tǒng)一凍存于-80℃。取樣完成后,提取病毒RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real time reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)檢測(cè)病毒體外動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn),比較不同毒株在體外的復(fù)制動(dòng)力學(xué)差異；5.將一日齡ICR乳鼠分為8組,每組11只,實(shí)驗(yàn)組乳鼠分別用SDLY 107株、SDLY1株、SDLY 107-2A-1株感染,每株病毒接種兩組,另設(shè)兩組對(duì)照組；另將一周齡ICR乳鼠分為5組,每組11只,將SDLY 107株、SDLY1株、SDLY107-2A-1株分別感染一組一周齡ICR乳鼠,另設(shè)一組對(duì)照組；感染途徑為腹腔注射,其中對(duì)照組用生理鹽水注射；每天觀察一日齡乳鼠感染組及對(duì)照組的臨床體征并記錄乳鼠體重；6.在感染后0 d-11 d連續(xù)采集乳鼠后肢肌肉組織,提取病毒RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,利用qRT-PCR檢測(cè)病毒在體內(nèi)復(fù)制曲線(xiàn)；在感染后1 d、5 d和9d采集乳鼠肺組織、腦組織、后肢肌肉組織和小腸組織,HE染色觀察乳鼠器官病變情況,免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒抗原；結(jié)果：1.PCR、間接免疫熒光、免疫印跡及測(cè)序證明嵌合病毒拯救成功,且測(cè)出SDLY107株、SDLY 1株、SDLY 107-2A-1株滴度分別為2.22×105PFU/ml、 0.65×105PFU/ml、1.25×105PFU/ml;2.LDH實(shí)驗(yàn)和CCK-8實(shí)驗(yàn)表明嵌合毒株SDLY 107-2A-1株對(duì)細(xì)胞的損傷作用弱于強(qiáng)毒株SDLY 107株,強(qiáng)于弱毒株SDLY1株(P0.05)；3. qRT-PCR結(jié)果顯示嵌合毒株SDLY 107-2A-1株在體外37℃和39.5℃條件下復(fù)制能力均弱于強(qiáng)毒株SDLY 107株,強(qiáng)于弱毒株SDLY1株；嵌合毒株在乳鼠體內(nèi)復(fù)制能力弱于強(qiáng)毒株,強(qiáng)于弱毒株；4.HE病理染色情況和免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明嵌合毒株對(duì)一日齡乳鼠器官造成的病理?yè)p傷介于強(qiáng)毒株和弱毒株之間；在乳鼠后肢肌肉組織中可檢測(cè)出嵌合毒株、強(qiáng)毒株及弱毒株的抗原,在腦組織中僅可檢測(cè)到嵌合毒株和強(qiáng)毒株的抗原。結(jié)論：1.成功拯救了嵌合體病毒SDLY 107-2A-1株,其產(chǎn)生的細(xì)胞病變效應(yīng)和親本病毒株SDLY 107株相似；2.EV71嵌合毒株和親本毒株在體內(nèi)外復(fù)制能力均有差異,表明2A蛋白在病毒復(fù)制能力過(guò)程中發(fā)揮作用,但2A蛋白并不是溫度敏感位點(diǎn)；3.EV71嵌合毒株和親本毒株對(duì)細(xì)胞和乳鼠器官組織的損傷作用均有差異,表明2A蛋白在病毒毒力中為關(guān)鍵蛋白；4.嵌合毒株和強(qiáng)毒株均可在腦中復(fù)制,但弱毒株在腦中沒(méi)有復(fù)制能力,這些結(jié)果說(shuō)明2A蛋白并不能影響病毒侵入神經(jīng)系統(tǒng)和在腦內(nèi)復(fù)制的能力,這說(shuō)明EV71是通過(guò)2A以外的機(jī)制侵入神經(jīng)系統(tǒng),這進(jìn)一步說(shuō)明了EV71的神經(jīng)毒力機(jī)制的復(fù)雜性。
【關(guān)鍵詞】：EV71 嵌合病毒 2A蛋白 病毒復(fù)制 毒力
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R373
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符號(hào)說(shuō)明13-16
• 前言16-22
• 材料和方法22-43
• 一、試劑22-30
• 二、儀器30-31
• 三、方法31-43
• 結(jié)果43-55
• 一、EV71毒株2A蛋白的氨基酸序列比對(duì)43
• 二、EV71嵌和病毒感染性克隆的構(gòu)建43-45
• 三、EV71嵌和病毒的拯救與鑒定45-48
• 四、EV71體外復(fù)制動(dòng)力學(xué)48-49
• 五、EV71對(duì)細(xì)胞的損傷49-50
• 六、EV71對(duì)ICR乳鼠的組織病理?yè)p傷50-52
• 七、EV71在乳鼠體內(nèi)的分布52-53
• 八、EV71體內(nèi)復(fù)制動(dòng)力學(xué)53-55
• 討論55-59
• 結(jié)論59-60
• 創(chuàng)新與不足之處60-61
• 附錄附圖61-63
• 參考文獻(xiàn)63-71
• 致謝71-72
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文及專(zhuān)利72-74
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表74

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本文編號(hào)：601797