本文關(guān)鍵詞：抗CD163兔單克隆抗體的開發(fā)及鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景抗體被廣泛應用于生物科學和制藥等行業(yè)中。其中,鼠單克隆抗體由于在特異性、親和力等方面較多克隆抗體更具優(yōu)勢,其發(fā)展和起步較兔單克隆抗體早,因此在研究、診斷和治療等領(lǐng)域占據(jù)了主導地位。然而,兔單克隆抗體以其更高的特異性、親和力及易于人源化等優(yōu)勢,不僅為科學界提供了更優(yōu)的選擇,也為診斷和治療領(lǐng)域提供了新的機遇。CD163,又名M130,為I型跨膜蛋白,屬于B族富半胱氨酸清道夫(SRCR)家族成員,特異性表達于單核細胞和巨噬細胞,可被免疫抑制劑糖皮質(zhì)激素和IL-10誘導表達。目前已知CD163具有多種重要功能：介導單核細胞結(jié)合到細菌上,導致炎性細胞因子釋放；參與循環(huán)清除觸珠蛋白和血紅蛋白復合物以及游離血紅蛋白；可以介導單核細胞與成紅細胞粘附,促進紅細胞的擴張；結(jié)合并內(nèi)化TWEAK細胞因子,當動脈粥樣硬化發(fā)生時,sCD163和TWEAK在血漿中的比例將會提高。研究亦發(fā)現(xiàn)CD163在自身免疫性疾病、腫瘤、肝衰竭等方面具有較好的臨床價值和應用前景。目的制備多應用、高親和力、特異性CD163兔單克隆抗體。方法通過設計合成一條特異性免疫原免疫兔子,利用改進的兔雜交瘤技術(shù)制備CD163抗體。通過ELISA、WB、 IHC-P、ICC等方法實現(xiàn)多抗血清和雜交瘤上清的初篩,篩選得到的最佳陽性雜交瘤的重鏈、輕鏈基因經(jīng)過克隆和表達,重組抗體通過ELISA、WB、IHC-P、 IHC-Fr等方法驗證,其中WB和IHC-P檢測結(jié)合文獻描述,增加了陰性細胞和組織作為有效的特異性驗證手段。結(jié)果本課題共篩選到ELISA陽性克隆68個,其中8個為WB陽性克隆,這8個克隆在多個陽性裂解液中可檢測到分子量約為150kDa的目的條帶,并且在文獻報道陰性細胞或組織裂解液中呈陰性結(jié)果。其中編號23號克隆還可應用于其他物種(人和大鼠),并且在IHC-P、IHC-Fr的檢測中顯示了良好的組織特異性作為最佳克隆進入生產(chǎn)。結(jié)論我們成功開發(fā)了一個能應用于多物種(人、小鼠和大鼠)、具備多種應用(ELISA、WB、IHC-P、 IHC-Fr)的特異性CD163兔單克隆抗體,填補了商品化優(yōu)質(zhì)CD163兔單克隆抗體的空白,具有很好的市場競爭力,將為研究、診斷和治療等領(lǐng)域提供新機遇。
【關(guān)鍵詞】：兔單克隆抗體 CD163 重組抗體
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 致謝5-6
• 中文摘要6-7
• ABSTRACT7-9
• 主要縮略詞9-14
• 第一章 緒論14-21
• 1.1 抗體14-16
• 1.1.1 抗體的歷史14-15
• 1.1.2 抗體的結(jié)構(gòu)15-16
• 1.1.3 抗體的應用16
• 1.1.4 抗體的分類16
• 1.2 CD163及其研究現(xiàn)狀16-21
• 1.2.1 CD163分子特征17-18
• 1.2.2 CD163的表達和調(diào)節(jié)18
• 1.2.3 CD163的生物學功能18-20
• 1.2.4 CD163在臨床中的應用20
• 1.2.5 展望20-21
• 第二章 兔多抗血清的制備及鑒定21-33
• 2.1 實驗材料21-24
• 2.1.1 免疫原21-22
• 2.1.2 實驗動物(組織)22
• 2.1.3 主要實驗器材22-23
• 2.1.4 主要試劑及配置23-24
• 2.2 實驗方法24-29
• 2.2.1 免疫24-25
• 2.2.2 多抗血清的親和純化25
• 2.2.3 抗血清效價測定25-26
• 2.2.4 Western blot檢測26-29
• 2.3 實驗結(jié)果29-32
• 2.3.1 兔抗血清效價29-30
• 2.3.2 抗血清Western blot結(jié)果30-32
• 2.4 本章小結(jié)32-33
• 第三章 雜交瘤細胞的制備和篩選33-48
• 3.1 實驗材料34-37
• 3.1.1 細胞來源34
• 3.1.2 主要器材及設備34-35
• 3.1.3 主要試劑及配置35-37
• 3.1.3.1 主要試劑35-37
• 3.2 實驗方法37-45
• 3.2.1 細胞融合37-38
• 3.2.2 雜交瘤細胞篩選38-45
• 3.3 實驗結(jié)果45-47
• 3.3.1 細胞融合結(jié)果45
• 3.3.2 ELISA結(jié)果45-46
• 3.3.3 Western Blot結(jié)果46
• 3.3.4 IHC結(jié)果46-47
• 3.3.5 ICC結(jié)果47
• 3.4 本章小節(jié)47-48
• 第四章 重組CD163抗體的制備和鑒定48-61
• 4.1 實驗材料48-50
• 4.1.1 細胞、質(zhì)粒來源48
• 4.1.2 主要器材及設備48-49
• 4.1.3 主要試劑及配置49-50
• 4.2 實驗方法50-56
• 4.2.1 雜交瘤細胞mRNA的提取及CD163基因重鏈、輕鏈的擴增50-52
• 4.2.2 PCR產(chǎn)物的回收52-53
• 4.2.3 質(zhì)粒構(gòu)建及酶切鑒定53-55
• 4.2.4 重組CD163質(zhì)粒轉(zhuǎn)染55-56
• 4.2.5 重組抗體生產(chǎn)及鑒定56
• 4.3 實驗結(jié)果56-60
• 4.3.1 HC和LC PCR結(jié)果56-57
• 4.3.2 HC質(zhì)粒和LC質(zhì)粒酶切結(jié)果57
• 4.3.3 重組CD163兔單克隆抗體質(zhì)檢結(jié)果57-60
• 4.4 本章小結(jié)60-61
• 第五章 結(jié)論與展望61-62
• 參考文獻62-66
• 作者簡介66

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