本文關(guān)鍵詞：凍融—凍干法制備狂犬疫苗脂質(zhì)體及其細胞免疫研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒感染所致的以損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主的急性傳染病,屬于人獸共患的自然疫源性疾病,一旦發(fā)病,病死率幾乎100%。目前應用狂犬疫苗接種是預防狂犬病的有效方法。傳統(tǒng)的滅活狂犬疫苗雖然具備了制作工藝簡單的特點,但仍存在滅活過程中有可能改變有效的抗原決定簇、免疫應答時間不長、需要多次免疫等問題；鋁佐劑疫苗雖然在一定程度上克服了以上缺點,但存在產(chǎn)生抗體遲緩、副反應多等缺點,因此,尋找能使機體較早產(chǎn)生抗體且能增強細胞免疫的安全疫苗佐劑成為現(xiàn)今研究狂犬疫苗的熱點。本課題以脂質(zhì)體作為疫苗佐劑,采用薄膜分散聯(lián)合凍融-凍干法,在已確定的制備狂犬疫苗脂質(zhì)體最優(yōu)工藝的基礎上,制備了一批狂犬疫苗脂質(zhì)體凍干粉,并考察其粒子狀態(tài)、粒度分布和包封率；將狂犬疫苗脂質(zhì)體混懸液和凍干粉置于4℃、25±2℃和37±2℃條件下進行物理穩(wěn)定性試驗,不同的時間點取樣,以顯微觀察外觀和包封率為指標考察其穩(wěn)定性；脂質(zhì)體包封率為(85.29±2.43)%(n=5),在MoticB5型數(shù)碼電子顯微鏡(Oil, 100x)下觀察,其形態(tài)呈圓形或橢圓形,粒度分布均勻,平均粒徑為3.89μm;在脂質(zhì)體物理穩(wěn)定性考察中,4℃和25±2℃儲存條件下,脂質(zhì)體凍干粉30天內(nèi)的包封率仍下降不明顯,表明凍干粉的穩(wěn)定性較好。將疫苗原液分別稀釋成4倍、6倍和8倍,然后制成脂質(zhì)體凍十粉,分別免疫小鼠并篩選出最佳稀釋倍數(shù),4倍稀釋脂質(zhì)體的細胞刺激指數(shù)較高,選擇其為最佳稀釋倍數(shù)；用疫苗原液、疫苗脂質(zhì)體、最佳稀釋倍數(shù)脂質(zhì)體分別腹腔三針免疫清潔級KM小鼠,抗原給藥量相同,生理鹽水作為對照,28天后以細胞免疫考察其免疫原性,包括體外實驗MTT法檢測淋巴細胞增殖能力和流式細胞儀檢測淋巴細胞表面標記。結(jié)果顯示,疫苗原液組、疫苗脂質(zhì)體組、4倍稀釋組與空白對照組比較,均能刺激機體產(chǎn)生細胞免疫(P0.05)；疫苗脂質(zhì)體組和疫苗原液組之間SI值差異有顯著意義(t=11.483,P0.05),4倍稀釋組和疫苗原液組之間SI值差異有顯著意義(t=-15.931,P0.05),4倍稀釋組和疫苗脂質(zhì)體組之間SI值差異有顯著意義(t=-8.537,P0.05),表明狂犬疫苗脂質(zhì)體和4倍稀釋疫苗脂質(zhì)體免疫機體誘導其產(chǎn)生的細胞免疫水平明顯高于疫苗原液,且疫苗4倍稀釋疫苗脂質(zhì)體優(yōu)于狂犬疫苗脂質(zhì)體。疫苗原液組、疫苗脂質(zhì)體組和4倍稀釋組小鼠CD4+/CD8+比值與對照組比較,P值均小于0.05,表明疫苗原液、疫苗脂質(zhì)體和原液4倍稀釋脂質(zhì)體都能刺激機體產(chǎn)生細胞免疫,狂犬疫苗脂質(zhì)體組與疫苗原液組之間CD4+/CD8+比值差異有顯著意義(t=11.288,P0.05),4倍稀釋組和疫苗原液組之間CD4+/CD8+比值差異有顯著意義(t=-9.067,P0.05),4倍稀釋組和疫苗脂質(zhì)體組之間CD4+/CD8+比值差異有顯著意義(t=4.789,P0.05),表明狂犬疫苗脂質(zhì)體和原液4倍稀釋脂質(zhì)體免疫機體誘導其產(chǎn)生的細胞免疫水平明顯高于狂犬疫苗原液,且原液4倍稀釋脂質(zhì)體優(yōu)于狂犬疫苗脂質(zhì)體,也表明狂犬疫苗脂質(zhì)體可增強機體的細胞免疫。以上結(jié)果說明凍融-凍干法是一種可行的制備狂犬疫苗脂質(zhì)體的工藝;該方法制備的狂犬疫苗脂質(zhì)體免疫誘導機體產(chǎn)生的細胞免疫水平明顯高于狂犬疫苗原液,且疫苗4倍稀釋后制備的脂質(zhì)體優(yōu)于狂犬疫苗脂質(zhì)體。脂質(zhì)體作為佐劑的狂犬疫苗可增強機體的細胞免疫。
【關(guān)鍵詞】：凍融-凍干法 Vero細胞狂犬疫苗 脂質(zhì)體 穩(wěn)定性 細胞免疫
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392-33
【目錄】：

• 縮略詞表(以字母順序排列)6-7
• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 第一章 前言12-18
• 1. 狂犬病概述12-13
• 2. 狂犬疫苗應用現(xiàn)狀13-15
• 3. 脂質(zhì)體狂犬疫苗研究現(xiàn)狀15-17
• 4. 本課題設計17-18
• 第二章 凍融-凍干法制備狂犬疫苗脂質(zhì)體及其理化性質(zhì)的研究18-31
• 1. 材料18-19
• 1.1 狂犬病疫苗18
• 1.2 實驗試劑18-19
• 1.3 實驗主要儀器設備19
• 2. 方法19-23
• 2.1 凍融-凍干法制備狂犬疫苗脂質(zhì)體19-21
• 2.1.1 薄膜分散法制備空白脂質(zhì)體20
• 2.1.2 超聲法制備單層脂質(zhì)體20-21
• 2.1.3 凍融法制備狂犬疫苗脂質(zhì)體21
• 2.1.4 冷凍干燥法制備狂犬疫苗脂質(zhì)體凍干粉21
• 2.2 狂犬疫苗脂質(zhì)體的形態(tài)觀察與粒度分析21
• 2.3 Lowry法測定狂犬疫苗脂質(zhì)體的包封率21-23
• 2.3.1 標準溶液的配制22
• 2.3.2 蛋白含量測定的標準曲線繪制22-23
• 2.3.3 狂犬疫苗原液蛋白含量的測定23
• 2.3.4 狂犬疫苗脂質(zhì)體蛋白含量的測定23
• 2.4 狂犬疫苗脂質(zhì)體物理穩(wěn)定性考察23
• 3. 結(jié)果23-29
• 3.1 狂犬疫苗脂質(zhì)體凍干粉的形態(tài)觀察與粒度分布23-25
• 3.2 狂犬疫苗脂質(zhì)體包封率測定結(jié)果25-27
• 3.3 狂犬疫苗脂質(zhì)體物理穩(wěn)定性考察27-29
• 4. 討論29-31
• 4.1 凍融-凍干法制備脂質(zhì)體的特點29
• 4.2 冷凍干燥技術(shù)能提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性29-31
• 第三章 狂犬疫苗脂質(zhì)體細胞免疫研究31-44
• 1. 材料32-33
• 1.1 狂犬病疫苗32
• 1.2 實驗試劑32
• 1.3 實驗動物32
• 1.4 實驗主要儀器設備32-33
• 2. 方法33-36
• 2.1 脾淋巴細胞轉(zhuǎn)換實驗(MTT)33-34
• 2.1.1 淋巴細胞轉(zhuǎn)換實驗試劑配制33-34
• 2.1.2 脾淋巴細胞懸液的制備34
• 2.1.3 MTT法檢測細胞增殖34
• 2.2 預實驗動物分組34-35
• 2.3 正式動物分組35
• 2.4 T淋巴細胞表面標記實驗35-36
• 2.4.1 脾淋巴細胞懸液的制備35
• 2.4.2 動物分組35
• 2.4.3 流式細胞儀檢測T淋巴細胞表面標記實驗35-36
• 3. 結(jié)果36-43
• 3.1 預實驗小鼠脾淋巴細胞增殖實驗結(jié)果36-37
• 3.2 正式實驗小鼠脾淋巴細胞增殖實驗結(jié)果37-38
• 3.4 小鼠T淋巴細胞免疫標記38-43
• 4. 討論43-44
• 全文小結(jié)44-45
• 參考文獻45-48
• 第四章 綜述 新型狂犬疫苗的研究進展48-57
• 1. 新型狂犬疫苗的分類49
• 2. 重組疫苗49-51
• 2.1 大腸桿菌為載體49
• 2.2 活病毒為載體49-50
• 2.3 非復制病毒或復制缺陷病毒為載體50
• 2.4 植物病毒或菌為載體50-51
• 3. 減毒活疫苗51-52
• 4. DNA疫苗52-53
• 5. 亞單位、多肽疫苗53-54
• 5.1 亞單位疫苗53
• 5.2 多肽疫苗53-54
• 6. 展望54-55
• 參考文獻55-57
• 攻讀學位期間獲得的學術(shù)成果57-58
• 致謝58

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本文編號：499769