本文關鍵詞：利用單細胞PCR從免疫后中國獼猴篩選H7N9高親和力中和抗體，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：流感病毒目前是威脅人類健康的重大因素。近年來發(fā)生的禽流感H7N9、H5N6和H10N8感染人事件導致發(fā)病嚴重、死亡率高,對人類健康、經(jīng)濟發(fā)展和社會穩(wěn)定等帶來嚴重影響。目前主要應對流感病毒的措施是疫苗和抗病毒藥物治療。疫苗是預防流感病毒感染最有效的方式之一,但對目前突發(fā)的新亞型流感毒株缺乏保護作用;抗病毒藥物在新病毒產(chǎn)生耐藥株之前有治療作用,感染后期治療效果不明顯。目前的抗流感藥物包括M2離子通道蛋白抑制劑和神經(jīng)氨酸酶(NA)抑制劑,例如金剛烷胺和奧司他韋,雖然能有效抑制病毒復制,但容易出現(xiàn)耐藥株。流感感染康復者的血清可以產(chǎn)生高滴度的抗體,能夠有效地救治流感臨床重癥者,然而康復者有限,很難獲得大量血漿,這難以應對流感大范圍的爆發(fā),并且還受到康復者血清抗體效價不均一等因素影響。本課題首先利用中國獼猴與人在遺傳上具有高度同源的特點,用流感病毒疫苗免疫恒河猴,刺激B細胞產(chǎn)生中和抗體,并通過多次免疫的方法提高中和抗體的親和力。然后,從免疫恒河猴外周血分離B細胞,獼猴的漿母細胞表型與人不同,用流式細胞分選儀,獲得CD3-/CD19-/CD27-/CD80+標記的B細胞,利用單細胞PCR技術,在單細胞孔中克隆抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)基因,并在293T細胞中進行體外表達,得到重鏈和輕鏈可變區(qū)配對的抗體。該方法主要應用于漿母細胞和記憶性B細胞的克隆,相比于傳統(tǒng)的抗體制備方法具有效率高、全人源、基因多樣性更豐富等優(yōu)勢并體外表達抗體。最后,應用ELISA法檢測抗原抗體親和力、生物膜層干涉技術對親和力進行定量分析、病毒微量中和實驗檢測抗體中和水平等方法,對抗體進行體外特性分析。利用上述實驗方法,本實驗篩選出一株高親和力中和抗體2G11。利用ELISA實驗檢測抗體2G11與H7N9-Anhui蛋白的親和力,結(jié)果顯示:2G11可以結(jié)合H7N9-Anhui株,并且相比文獻報道的流感廣譜中和抗體FI6,2G11個結(jié)合活性是FI6的1000倍以上。同時Western Blot結(jié)果也顯示2G11可以與H7N9-Anhui株蛋白很好地結(jié)合。利用病毒微量中和實驗檢測抗體中和病毒的能力,實驗結(jié)果證明2G11抗體能顯著中和H7N9流感病毒,實驗數(shù)據(jù)顯示,77μg/ml的抗體上清,按1:320稀釋后依然可以中和90%的病毒,中和活性遠遠高于報道的FI6抗體。除此之外,生物膜核磁共振實驗結(jié)果也同步顯示2G11具有很強的親和力,親和力達到0.6 n M。血凝抑制實驗證明2G11具有很高的中和滴度。本研究通過單細胞PCR技術從免疫的獼猴體內(nèi)成功篩選到一株針對H7N9流感病毒的高親和力中和抗體,為指導疫苗研制和臨床救治提供了新的思路。
【關鍵詞】：流感病毒 H7N9 中國獼猴 高親和力 中和抗體 單細胞PCR
【學位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要3-5
• abstract5-7
• 英文縮寫詞7-12
• 1 前言12-26
• 1.1 H7N9的簡介和研究現(xiàn)狀12-17
• 1.1.1 H7N9的簡介12-15
• 1.1.2 流感大流行和不斷出現(xiàn)的流感感染人事件15-16
• 1.1.3 流感病毒預防與治療的研究進展16-17
• 1.2 抗體結(jié)構和功能簡介17-22
• 1.2.1 抗體的結(jié)構17-18
• 1.2.2 抗體功能介紹18
• 1.2.3 抗體基因的多樣性18-20
• 1.2.3.1 抗體多樣性的遺傳學說18-19
• 1.2.3.2 V（D）J重組19
• 1.2.3.3 高頻突變與親和力成熟19-20
• 1.2.4 抗體的種類20-22
• 1.2.4.1 多克隆抗體20
• 1.2.4.2 單克隆抗體20-22
• 1.3 抗體篩選的技術22-26
• 1.3.1 噬菌體展示技術的簡介22-23
• 1.3.2 酵母展示技術篩選抗體23
• 1.3.3 B細胞永生化23-24
• 1.3.4 單細胞PCR技術24-26
• 2 材料與方法26-48
• 2.1 實驗材料26-28
• 2.1.1 分子克隆相關材料26
• 2.1.2 細胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相關試劑26
• 2.1.3 流感病毒26
• 2.1.4 SDS-PAGE膠考馬斯亮藍染色26
• 2.1.5 ELISA26-27
• 2.1.6 病毒微量中和實驗27
• 2.1.7 血凝抑制實驗（HI）27
• 2.1.8 Western blot實驗材料27
• 2.1.9 BCA蛋白定量實驗27
• 2.1.10 涉及的分析網(wǎng)站和分析軟件27-28
• 2.2 實驗儀器28-29
• 2.3 實驗方法29-48
• 2.3.1 獼猴免疫30
• 2.3.2 獼猴PBMC分離30
• 2.3.3 獼猴PBMC抗體染色和流式分選30-31
• 2.3.4 單細胞PCR擴增31-33
• 2.3.5 一步法無縫克隆抗體基因33-39
• 2.3.5.1 抗體基因p CI-neo-Ig G1, p CI-neo-K/L線性載體制備35
• 2.3.5.2 線性化載體去甲基化35
• 2.3.5.3 線性化載體純化35-36
• 2.3.5.4 抗體基因連接到對應載體上36
• 2.3.5.5 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化36-37
• 2.3.5.6 挑取單克隆細菌和菌液PCR鑒定37-38
• 2.3.5.7 陽性克隆送測序38
• 2.3.5.8 測序結(jié)果分析38
• 2.3.5.9 測序正確的菌液擴大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒38-39
• 2.3.6 抗體基因在 293T細胞中的表達39-40
• 2.3.7 SDS-PAGE及考馬斯亮藍檢測抗體表達40-41
• 2.3.7.1 SDS-PAGE蛋白電泳40
• 2.3.7.2 SDS-PAGE膠考馬斯亮藍染色40-41
• 2.3.8 抗體凝縮和純化41-42
• 2.3.8.1 細胞抗體上清離心超濾濃縮41
• 2.3.8.2 濃縮后抗體純化實驗41-42
• 2.3.8.3 SDS-PAGE膠鑒定純化產(chǎn)物42
• 2.3.8.4 BCA法測定純化產(chǎn)物濃度42
• 2.3.9 抗體與H7N9的HA蛋白結(jié)合能力檢測42-43
• 2.3.10 生物膜層干涉技術（BLI）檢測抗原抗體親和力43-44
• 2.3.11 Western Blot方法檢測抗體結(jié)合HA蛋白表位44-45
• 2.3.12 熒光病毒微量中和實驗檢測抗體中和滴度45-46
• 2.3.13 血凝抑制實驗46-48
• 2.3.13.1 8單位抗原制備46
• 2.3.13.2 HI實驗46-48
• 3 結(jié)果與分析48-61
• 3.1 獼猴免疫滅活H7N9流感疫苗的抗體反應48-49
• 3.2 流式分選單個獼猴漿母細胞49
• 3.3 單細胞PCR獲得H7N9抗體基因49-50
• 3.4 H7N9抗體基因克隆和表達載體構建50-52
• 3.4.1 H7N9抗體基因擴增50-51
• 3.4.2 抗體基因與載體連接后鑒定51-52
• 3.4.3 2G11基因的序列分析52
• 3.5 H7N9抗體表達、鑒定和純化52-54
• 3.5.1 SDS-PAGE檢測抗體的表達52-53
• 3.5.2 2G11抗體純化53-54
• 3.6 H7N9抗體活性分析54-58
• 3.6.1 ELISA檢測 2G11與H7N9-HA結(jié)合能力54-56
• 3.6.2 Western blot分析抗原抗體結(jié)合表位56-57
• 3.6.3 生物膜層干涉技術檢測抗原抗體親和力57-58
• 3.7 病毒微量中和實驗檢測抗體中和活性58-59
• 3.8 HI血凝抑制檢測抗體中和滴度59-61
• 4 討論與結(jié)論61-63
• 4.1 討論61-62
• 4.1.1 分離漿母細胞篩選抗體是有效分離高親和力抗體的方法61
• 4.1.2 獼猴漿母細胞抗體篩選難度大61-62
• 4.1.3 單細胞PCR篩選抗體的技術可靠性62
• 4.2 結(jié)論62-63
• 致謝63-64
• 參考文獻64-71
• 附錄71-81

  本文關鍵詞：利用單細胞PCR從免疫后中國獼猴篩選H7N9高親和力中和抗體，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：453053