本文關(guān)鍵詞：Slit2蛋白過表達(dá)對阿爾茲海默癥模型鼠發(fā)病的影響及其機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：【目的】前期研究結(jié)果提示我們,Slit2過表達(dá)會導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)記憶力損傷,并出現(xiàn)類似AD模型鼠Tg2576的腦部神經(jīng)元空泡樣變性,神經(jīng)元丟失及代謝物的異常等。因此,本實驗將過表達(dá)Slit2蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠與轉(zhuǎn)入了人源性的APP695基因的AD模型鼠Tg2576進行雜交,建立了Slit2蛋白過表達(dá)的AD模型鼠,并對該小鼠進行行為學(xué)、組織病理學(xué)、分子生物學(xué)等方面的研究,以探討Slit2蛋白過表達(dá)對阿爾茲海默癥發(fā)病的影響。【方法】1.Slit2過表達(dá)AD模型鼠的構(gòu)建和行為學(xué)研究。使用6-8周齡的轉(zhuǎn)基因小鼠進行繁殖,選取雄性Tg2576小鼠與雌性Slit2-Tg小鼠進行雜交,對子代進行PCR基因鑒定后篩選出Slit2-Tg小鼠、Tg2576小鼠、Tg2576;Slit2小鼠及野生型(WT)小鼠。對3、6、9月齡的小鼠進行行為學(xué)檢測,包括避暗實驗、Morris水迷宮實驗、曠場迷宮實驗及高架十字迷宮實驗。2.Slit2過表達(dá)AD模型鼠的病理特征研究。采用HE染色觀察小鼠腦內(nèi)病理形態(tài)學(xué)改變;免疫組化和Western Blot測定小鼠的腦內(nèi)beta amyloid蛋白的表達(dá)情況;ELISA對各組小鼠腦組織及血清中Aβ1-40及Aβ1-42的含量進行檢測。同時對腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶的表達(dá)情況及小膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況進行觀察。3.Slit2過表達(dá)影響AD的機制研究。采用HE染色,Evans Blue實驗,活體成像實驗對Slit2-Tg小鼠腦血管功能的檢測,進一步采用免疫組化對腦血管上Aβ轉(zhuǎn)運體RAGE和P-g P進行觀察�！窘Y(jié)果】1.PCR鑒定基因型結(jié)果:Tg2576;Slit2小鼠在428b和1000bp處均有清晰條帶,Slit2-Tg小鼠僅在1000bp處有清晰條帶,Tg2576小鼠僅在428bp處有清晰條帶,WT小鼠無目的基因,故無條帶顯示。2.行為學(xué)結(jié)果顯示:避暗實驗結(jié)果說明Tg2576;Slit2-Tg小鼠與Tg2576小鼠相比,錯誤次數(shù)更多,潛伏期更短。Morris水迷宮實驗中,定位航行實驗說明,Tg2576;Slit2小鼠表現(xiàn)出逃避潛伏期較長的趨勢;空間探索實驗說明,與Tg2576小鼠相比,Tg2576;Slit2小鼠在平臺象限路程百分比,時間百分比均減少,有顯著性差異。進一步利用行為學(xué)對其焦慮指標(biāo)進行檢測,由曠場迷宮實驗結(jié)果可以看出,9月齡時,與Tg2576小鼠相比,Tg2576;Slit2小鼠在中央?yún)^(qū)域路程百分比明顯減少,有顯著性差異。由高架十字迷宮實驗結(jié)果可以看出,9月齡時,與Tg2576小鼠相比,Tg2576;Slit2小鼠在進入開臂區(qū)域路程百分比、進入開臂次數(shù)百分比減少明顯,有顯著性差異。3.HE染色結(jié)果可以看出:WT小鼠腦部神經(jīng)元細(xì)胞完整,細(xì)胞數(shù)目較多,排列整齊;而與WT小鼠相比,其余各組小鼠均出現(xiàn)神經(jīng)元空泡樣變性,細(xì)胞排列疏松,其中Tg2576;Slit2小鼠較為嚴(yán)重。4.免疫組化與Western Blot檢測小鼠腦內(nèi)beta amyloid蛋白結(jié)果顯示:Tg2576;Slit2小鼠腦內(nèi)beta amyloid蛋白的陽性表達(dá)明顯增多,形成黃褐色淀粉樣斑塊。同時,Western blot結(jié)果半定量說明Tg2675;Slit2小鼠腦內(nèi)beta amyloid蛋白的表達(dá)水平比Tg2675小鼠有顯著性的增高。進一步對12月齡四組小鼠腦組織及血清中Aβ1-40和Aβ1-42的含量檢測結(jié)果顯示:Slit2過表達(dá)后,Tg2576;Slit2小鼠腦組織Aβ1-40,Aβ1-42的含量顯著性高于Tg2576小鼠,而在血清中Aβ1-40,Aβ1-42的含量并沒有明顯差異,最終導(dǎo)致Aβ1-40在腦組織與血清中的比率明顯增加,但Aβ1-42在腦組織與血清中的比率并未明顯增加。5.免疫組化檢測12月齡各組小鼠皮層和海馬中乙酰膽堿酯酶的表達(dá)發(fā)現(xiàn):Slit2過表達(dá)后,表現(xiàn)為Tg2576;Slit2小鼠腦組織中ACh E的含量顯著性高于Tg2576小鼠。6.免疫熒光與免疫組化實驗相結(jié)合檢測12月齡各組小鼠腦部小膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況發(fā)現(xiàn):在皮層區(qū)域,小膠質(zhì)細(xì)胞激活比較明顯。與WT小鼠相比,Tg2576小鼠,Tg2576;Slit2小鼠皮層均出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞胞體腫脹,小膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的激活。7.HE染色結(jié)果顯示Slit2-Tg小鼠脈絡(luò)叢結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破壞,Evans Blue及活體成像實驗說明Slit2-Tg小鼠會出現(xiàn)血腦屏障滲透增加。進一步檢測12月齡各組小鼠腦部Aβ轉(zhuǎn)運體RAGE和P-g P的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn):Tg2576;Slit2小鼠腦血管上RAGE的表達(dá)有所增強,p-gp的表達(dá)明顯減少�！窘Y(jié)論】1.本實驗成功構(gòu)建了Slit2蛋白過表達(dá)的AD模型鼠(Tg2576;Slit2)。2.Tg2576;Slit2小鼠比Tg2576小鼠有更明顯的學(xué)習(xí)和記憶的障礙,并且有焦慮的表現(xiàn)。3.Tg2576;Slit2小鼠腦部更易出現(xiàn)Aβ蛋白的沉積,同時乙酰膽堿酯酶表達(dá)增多,炎癥細(xì)胞激活。4.其機制可能與Slit2過表達(dá)導(dǎo)致血腦屏障破壞,從而使血腦屏障上的Aβ轉(zhuǎn)運體的表達(dá)出現(xiàn)異常有關(guān)。5.Tg2576;Slit2小鼠可作為研究腦血管損傷對阿爾茲海默病作用的動物模型。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茲海默癥 Slit2蛋白 Tg2576 Slit2小鼠 腦血管損傷
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R749.16;R-332
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 1. 前言11-15
• 2. 實驗材料與方法15-33
• 2.1. 實驗材料15-22
• 2.1.1 實驗動物15
• 2.1.2 主要實驗儀器15-17
• 2.1.3 主要實驗試劑17-18
• 2.1.4 實驗所用抗體18-22
• 2.2. 實驗方法22-33
• 2.2.1 轉(zhuǎn)基因動物建系22-24
• 2.2.2 避暗實驗24
• 2.2.3 Morris水迷宮實驗24-25
• 2.2.4 曠場迷宮25
• 2.2.5 高架十字迷宮25-26
• 2.2.6 小鼠的眼緣靜脈取血26
• 2.2.7 小鼠的心臟灌注26
• 2.2.8 制作組織切片26-27
• 2.2.9 蘇木精-伊紅（HE）染色27
• 2.2.10 免疫組化方法27-28
• 2.2.11 免疫熒光方法28-29
• 2.2.12 Western Blot29-31
• 2.2.13 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）31-32
• 2.2.14 活體成像實驗32
• 2.2.15 Evans Blue實驗32-33
• 2.2.16 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計方法33
• 3. 實驗結(jié)果33-48
• 3.1. Slit2過表達(dá)AD模型鼠的構(gòu)建和行為學(xué)研究33-39
• 3.1.1 小鼠基因型鑒定33-34
• 3.1.2 小鼠日常觀察34
• 3.1.3 避暗實驗34-35
• 3.1.4 Morris水迷宮實驗35-37
• 3.1.5 曠場迷宮37-38
• 3.1.6 高架十字迷宮38-39
• 3.2. Slit2過表達(dá)AD模型鼠的病理特征研究39-44
• 3.2.1 對小鼠皮層及海馬結(jié)構(gòu)的影響39
• 3.2.2 對小鼠腦部Aβ蛋白的影響39-42
• 3.2.3 小鼠皮層和海馬中乙酰膽堿酯酶的表達(dá)42-43
• 3.2.4 小鼠皮層中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況觀察43-44
• 3.3. Slit2蛋白過表達(dá)影響AD的機制研究44-48
• 3.3.1 影響小鼠的脈絡(luò)叢結(jié)構(gòu)44-45
• 3.3.2 對小鼠血腦屏障通透性的影響45-46
• 3.3.3 對小鼠血腦屏障上Aβ轉(zhuǎn)運體的影響46-48
• 4. 討論48-51
• 5. 小結(jié)51-52
• 參考文獻52-56
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文56-57
• 附錄： 縮寫詞中英文對照57-59
• 致謝59-60

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