本文關鍵詞：效應蛋白OspF參與志賀氏菌對氟喹諾酮類藥物敏感的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：細菌性痢疾是由志賀氏菌(shigella spp.)引起的全球性感染性疾病。據世界衛(wèi)生組織報告,全球約有1億人患有由志賀氏菌引起的疾病,死亡人數超過100萬。其中約95%以上的病例都發(fā)生在發(fā)展中國家,在我國每年也有約2千萬人感染細菌性痢疾。而且在臨床上,科學家們發(fā)現了許多多重耐藥的志賀菌株。隨著耐藥菌株的出現和擴散,給細菌性痢疾的有效治療帶來了困難。臨床上治療細菌性痢疾常用的抗生素有β內酰胺類的氨芐西林、磺胺甲基異惡唑或氟喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星和相對補液等。氟喹諾酮類藥物是目前治療細菌性痢疾的首要選擇。但是它們作用于志賀氏菌的具體機制尚未研究清晰。藥物與靶標相互作用的經典途徑主要有3種,第一種是抑制DNA的復制和修復,第二種是蛋白質合成的抑制,第三種是抑制細胞壁的合成。研究人員最近發(fā)現了一種新的機制,抗生素可以通過增加活性氧(ROS)的濃度,從而殺死細菌。ROS的產生與三羧酸循環(huán),NADH的瞬態(tài)損耗,不穩(wěn)定的鐵-硫簇,以及芬頓反應的產生相關。志賀氏菌對抗生素的耐受主要通過以下兩種機制,一種機制是抗生素靶基因的突變,另一種機制與外排泵系統(tǒng)的激活相關。志賀氏菌在感染宿主細胞時,其三型分泌系統(tǒng)會被激活,將效應蛋白分泌到宿主細胞內,引起細胞的炎癥反應。氟喹諾酮類藥物能以細菌內的DNA促旋酶和拓撲異構酶IV為靶標,干擾細菌DNA的復制從而達到殺菌的效果。氟喹諾酮類藥物還可以通過使細菌染色體片段化,在細菌體內形成藥-酶-DNA穩(wěn)定裂解復合物等方式來殺菌。目前也有許多關于志賀氏菌對喹諾酮藥物耐受機制的研究。細菌主要是通過以下幾個方式來降低藥物的殺傷力。第一種機制是細菌將編碼DNA促旋酶和拓撲異構酶IV的基因突變,這些突變在不改變酶活性的同時增加細菌對喹諾酮藥物的耐受。這是細菌對喹諾酮藥物耐受的主要機制。第二種機制是細菌內出現了一些耐藥性質粒,這些質粒能夠編碼一些能夠降低藥物與DNA促旋酶和拓撲異構酶IV結合能力的蛋白,有些還可以編碼與細菌外排泵相關的蛋白,使細菌主動將藥物轉運到體外。這種耐藥機制是可以隨著遺傳物質的復制時遺傳給下一代的。第三種是細菌染色體調節(jié)的對喹諾酮類藥物耐受的機制。近年來發(fā)現的細菌染色體上的一些基因可以調節(jié)細菌細胞膜蛋白通道上的孔蛋白,從而增加菌對藥物的耐受性。首先,我們測定了氟喹諾酮類藥物氧氟沙星對Shigella flexneri 2a 301野生株,突變株△Osp F,以及回補株的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC),發(fā)現突變株△Osp F相比其余兩個菌株對氧氟沙星藥物出現了明顯的耐受現象。隨后我們又檢測了莫西沙星,環(huán)丙沙星,諾氟沙星,萘啶酸這些氟喹諾酮藥物對這三株菌的MIC,發(fā)現了類似的情況,因此我們想要探究志賀氏菌△Osp F突變株對氟喹諾酮類藥物的耐受是怎樣進行調控的。在初步發(fā)現突變株△Osp F對氟喹諾酮藥物耐受這一現象后,我們隨后采用不同濃度梯度的氟喹諾酮類藥物處理這三株菌株,記錄菌株在藥物處理一定時間后的菌落形成單位(colony-forming unit,CFU),并計算存活率制作殺菌曲線,驗證突變株△Osp F對氟喹諾酮藥物的耐受表型。最后以過氧化氧(hydrogen peroxide,H202)處理以及厭氧環(huán)境培養(yǎng)菌株,來研究過氧化氫對志賀氏菌野生株和突變株的脅迫反應。實驗結果表明:志賀氏菌突變株△Osp F在經過莫西沙星,環(huán)丙沙星,諾氟沙星,環(huán)丙沙星,氧氟沙星,萘啶酸處理后,表現出對這些藥物的耐受表型。我們通過Western-blot以及PCR,證明了突變株以及回補株的成功構建。并且Western-blot驗證了Osp F蛋白重組表達成功的回補株與野生型菌株一樣對這些藥物表現出了敏感表型。在雙氧水耐受水平上,突變株△Osp F在較高濃度的雙氧水處理下比野生型菌株表現出了一定程度的耐受現象。并且在加了一定濃度的硫脲和2,2聯吡啶試劑后,能消除掉一定濃度的環(huán)丙沙星對野生型和突變株△Osp F引起的殺菌作用。我們在厭氧條件下,測定環(huán)丙沙星以及莫西沙星對野生型以及突變株的殺菌作用時,存活率比有氧條件下的存活要高。說明,活性氧的聚集能夠增加這些抗生素對志賀氏菌的殺菌效果,△Osp F突變株,能夠通過活性氧途徑,增加其菌株在相關致死因子脅迫下的存活率。因此,本研究證明了志賀氏菌效應蛋白Osp F能夠通過氧化壓力這條途徑來調控志賀氏菌對氟喹諾酮類藥物的敏感現象。
【關鍵詞】：志賀氏菌 氟喹諾酮類藥物 抗生素耐受 OspF 效應蛋白
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R378
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 第1章 綜述13-25
• 1.1 志賀氏菌的簡介13-19
• 1.1.1 志賀氏菌的分類及其基本特征13
• 1.1.2 志賀氏菌的致病機理13-16
• 1.1.3 三型分泌系統(tǒng)16-18
• 1.1.4 宿主的天然免疫系統(tǒng)對細菌入侵的應激反應18-19
• 1.2 氟喹諾酮類藥物發(fā)展歷程及作用機制19-22
• 1.2.1 氟喹諾酮類藥物的發(fā)展歷程19
• 1.2.2 氟喹諾酮類藥物的主要靶點19-20
• 1.2.3 斷裂復合體的形成與喹諾酮類藥物的殺菌效果20-21
• 1.2.4 染色體片段化對細菌的殺菌效果21
• 1.2.5 活性氧與殺菌效果間的關聯21-22
• 1.3 耐藥機制22-23
• 1.3.1 靶標介導的喹諾酮耐藥22
• 1.3.2 質粒調節(jié)的喹諾酮耐藥22-23
• 1.3.3 染色體調節(jié)的喹諾酮耐藥23
• 1.4 志賀氏菌效應蛋白OspF23-25
• 第2章 前言25-27
• 2.1 研究目的及意義25
• 2.2 研究內容與技術路線25-27
• 第3章 材料與方法27-41
• 3.1 實驗材料27-31
• 3.1.1 菌株和質粒27
• 3.1.2 實驗主要試劑27-28
• 3.1.3 實驗儀器28-29
• 3.1.4 主要培養(yǎng)基和溶液的配制29-31
• 3.2 實驗方法31-41
• 3.2.1 志賀氏菌OspF基因PCR引物設計與合成31
• 3.2.2 OspF基因的鑒定31
• 3.2.3 PCR產物凝膠回收31-32
• 3.2.4 OspF基因連接到Pet21a載體上，并轉化到Top10感受態(tài)中。32-33
• 3.2.5 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化33-34
• 3.2.6 質粒提取步驟34-35
• 3.2.7 Pet21a OspF重組菌菌液制備35
• 3.2.8 OspF蛋白的純化35-36
• 3.2.9 Shigella flexneri 2a 301野生株，突變株以及回補株中OspF蛋白的鑒定36-37
• 3.2.10 OspF抗體的制備37
• 3.2.11 OspF抗體的純化37-38
• 3.2.12 抗體效價的檢驗38
• 3.2.13 MIC測定38-39
• 3.2.14 檢測Shigella flexneri 2a 301野生株，突變株以及回補株中對氟諾酮類藥物的敏感性39
• 3.2.15 在一定濃度氟喹諾酮類藥物的處理下，Shigella flexneri 2a 301野生株，，突變株以及回補株存活率的測定39
• 3.2.16 雙氧水耐受測試39-40
• 3.2.17 硫脲，2,2 聯吡啶對藥物殺菌作用的影響40
• 3.2.18 厭氧環(huán)境對藥物殺菌作用的影響40
• 3.2.19 細菌體內活性氧的檢測40-41
• 第4章 結果與分析41-57
• 4.1 OspF基因的PCR擴增鑒定41-42
• 4.2 OspF蛋白的純化，以及抗體的制備與純化42-43
• 4.3 Western-blot檢測OspF基因在Shigella flexneri 2a 301野生株、△OspF突變株以及回補株中的表達43-44
• 4.4 生長速率的測定44-45
• 4.5 最小抑菌濃度的測定45-46
• 4.6 驗證突變株的耐受表型46
• 4.7 在單一藥物處理下存活率的測定46-50
• 4.8 志賀氏菌對雙氧水耐受測試50
• 4.9 2,2 聯吡啶與硫脲對抗生素殺菌作用的影響50-51
• 4.10 厭氧條件對抗生素殺菌效果的影響51-55
• 4.11 環(huán)丙沙星處理下，志賀氏菌內活性氧的變化55-57
• 第5章 討論與展望57-60
• 5.1 實驗結論57
• 5.2 討論57-58
• 5.3 展望58-60
• 參考文獻60-70
• 致謝70-72
• 在校期間發(fā)表論文72

【相似文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

1 朱芹;氟喹諾酮類藥物的合理應用[J];中國藥業(yè);2000年03期

2 李君霞;氟喹諾酮類藥物在治療結核中的應用[J];河南醫(yī)藥信息;2001年04期

3 袁志敏,劉豫隴;氟喹諾酮類藥物致精神異常1例[J];成都醫(yī)藥;2003年03期

4 Fred Gebhart ,李行 ,竟永華;氟喹諾酮類藥物是否需要警示語?[J];中國處方藥;2004年06期

5 林樺;;應用氟喹諾酮類藥物注意問題[J];海峽藥學;2007年11期

6 趙興奎;;氟喹諾酮類藥物的合理應用[J];現代中西醫(yī)結合雜志;2008年13期

7 周彥榮;;口服氟喹諾酮類藥物在我院門診的應用與調研分析[J];中國現代藥物應用;2009年07期

8 喬軍;;氟喹諾酮類藥物的合理應用[J];中國現代藥物應用;2010年09期

9 李會英,李培新;氟喹諾酮類藥物的副作用[J];陜西醫(yī)學雜志;1996年01期

10 傅德明;氟喹諾酮類藥物及其眼藥水[J];醫(yī)藥與保健;1999年03期

中國重要會議論文全文數據庫 前10條

1 黃曉虹;張曉娟;廖廣仁;;308例氟喹諾酮類藥物不良反應回顧性分析[A];2010年廣東省藥師周大會論文集[C];2011年

2 張曼;;氟喹諾酮類藥物的應用[A];第六屆全國抗菌藥物臨床藥理學術會議論文集[C];2006年

3 謝紅梅;;我院43例氟喹諾酮類藥物致不良反應報告分析[A];浙江省藥劑學術會議論文集[C];2006年

4 李勝前;楊思蕓;蒲青;曾友志;;氟喹諾酮類藥物致癲癇發(fā)作17例分析[A];第六屆四川省博士專家論壇論文集[C];2012年

5 李江華;李靜蔚;;氟喹諾酮類藥物不良反應綜合性分析[A];第8屆全國抗菌藥物臨床藥理學術會議暨北京大學臨床藥理研究所成立三十周年論文集[C];2010年

6 郭亦媛;;氟喹諾酮類藥物不良反應[A];山東省藥學會第一屆學術年會論文集（下）[C];2005年

7 易林高;吳明;;新氟喹諾酮類藥物的不良反應及合理應用[A];2006第六屆中國藥學會學術年會論文集[C];2006年

8 王乃毅;白小紅;;固相萃取-反相HPLC法同時快速測定血漿中4種氟喹諾酮類藥物[A];2006年全國藥物質量分析學術研討會——《藥物分析雜志》第二屆普析通用杯優(yōu)秀論文評選頒獎會論文集[C];2006年

9 丁政;楊洪波;;本院4季度使用氟喹諾酮類抗菌藥物臨床應用回顧性調查[A];第四屆全國藥學服務與研究學術論壇論文集[C];2011年

10 黃學銳;高微微;張旭霞;王u&民;潘毓萱;;三種氟喹諾酮類藥物(氧氟沙星、左氧氟沙星和司帕沙星)抗結核分支桿菌臨床耐藥界線的初步研究(摘要)[A];中華醫(yī)學會結核病學分會2002年學術會議論文匯編[C];2002年

中國重要報紙全文數據庫 前10條

1 東北農業(yè)大學 佟恒敏 劉芳萍;氟喹諾酮類藥物毒副作用不可忽視[N];中國畜牧報;2005年

2 本報記者 白毅;遏制氟喹諾酮類藥物細菌耐藥[N];中國醫(yī)藥報;2009年

3 本報記者 白毅;規(guī)范氟喹諾酮類藥物的臨床應用[N];中國醫(yī)藥報;2009年

4 本報記者 白毅;嚴防氟喹諾酮類藥物的不良反應[N];中國醫(yī)藥報;2009年

5 ;氟喹諾酮類藥物耐藥性不容忽視[N];中國醫(yī)藥報;2003年

6 莊愉;氟喹諾酮類藥物用于抗結核的研究[N];中國醫(yī)藥報;2001年

7 ;氟喹諾酮類藥物的合理應用[N];中國高新技術產業(yè)導報;2001年

8 王萌 賴鑫芬 任丹;呼吸氟喹諾酮類藥物——業(yè)績緊逼頭孢菌素類[N];中國醫(yī)藥報;2005年

9 常怡勇;氟喹諾酮類藥物可致肌腱病損[N];中國醫(yī)藥報;2003年

10 李成建;注意氟喹諾酮類藥物致癲癇[N];中國醫(yī)藥報;2004年

中國博士學位論文全文數據庫 前4條

1 朱翠云;耐氟喹諾酮結核分枝桿菌的藥敏特征、耐藥分子機制及其感染預后研究[D];復旦大學;2014年

2 李小紅;氟喹諾酮類藥物結構活性關系研究及里德堡鉀原子在激光場中的相干操縱[D];四川大學;2007年

3 邢廣旭;氟喹諾酮類藥物多殘留免疫學檢測技術研究[D];河南農業(yè)大學;2013年

4 劉曉強;寵物源大腸桿菌對氟喹諾酮類藥物的多藥耐藥機制研究[D];西北農林科技大學;2012年

中國碩士學位論文全文數據庫 前10條

1 崔夢琪;基于磺基水楊酸的水產品氟喹諾酮類藥物酶聯免疫檢測前處理技術研究[D];中國海洋大學;2015年

2 葉可;效應蛋白OspF參與志賀氏菌對氟喹諾酮類藥物敏感的研究[D];西南大學;2016年

3 栗瑞芬;離子選擇電極在氟喹諾酮類藥物含量測定中的研制與應用[D];河北醫(yī)科大學;2003年

4 王}

本文編號：450454