本文關(guān)鍵詞：效應(yīng)蛋白OspF參與志賀氏菌對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物敏感的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：細(xì)菌性痢疾是由志賀氏菌(shigella spp.)引起的全球性感染性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告,全球約有1億人患有由志賀氏菌引起的疾病,死亡人數(shù)超過(guò)100萬(wàn)。其中約95%以上的病例都發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家,在我國(guó)每年也有約2千萬(wàn)人感染細(xì)菌性痢疾。而且在臨床上,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了許多多重耐藥的志賀菌株。隨著耐藥菌株的出現(xiàn)和擴(kuò)散,給細(xì)菌性痢疾的有效治療帶來(lái)了困難。臨床上治療細(xì)菌性痢疾常用的抗生素有β內(nèi)酰胺類(lèi)的氨芐西林、磺胺甲基異惡唑或氟喹諾酮類(lèi)藥物環(huán)丙沙星和相對(duì)補(bǔ)液等。氟喹諾酮類(lèi)藥物是目前治療細(xì)菌性痢疾的首要選擇。但是它們作用于志賀氏菌的具體機(jī)制尚未研究清晰。藥物與靶標(biāo)相互作用的經(jīng)典途徑主要有3種,第一種是抑制DNA的復(fù)制和修復(fù),第二種是蛋白質(zhì)合成的抑制,第三種是抑制細(xì)胞壁的合成。研究人員最近發(fā)現(xiàn)了一種新的機(jī)制,抗生素可以通過(guò)增加活性氧(ROS)的濃度,從而殺死細(xì)菌。ROS的產(chǎn)生與三羧酸循環(huán),NADH的瞬態(tài)損耗,不穩(wěn)定的鐵-硫簇,以及芬頓反應(yīng)的產(chǎn)生相關(guān)。志賀氏菌對(duì)抗生素的耐受主要通過(guò)以下兩種機(jī)制,一種機(jī)制是抗生素靶基因的突變,另一種機(jī)制與外排泵系統(tǒng)的激活相關(guān)。志賀氏菌在感染宿主細(xì)胞時(shí),其三型分泌系統(tǒng)會(huì)被激活,將效應(yīng)蛋白分泌到宿主細(xì)胞內(nèi),引起細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。氟喹諾酮類(lèi)藥物能以細(xì)菌內(nèi)的DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV為靶標(biāo),干擾細(xì)菌DNA的復(fù)制從而達(dá)到殺菌的效果。氟喹諾酮類(lèi)藥物還可以通過(guò)使細(xì)菌染色體片段化,在細(xì)菌體內(nèi)形成藥-酶-DNA穩(wěn)定裂解復(fù)合物等方式來(lái)殺菌。目前也有許多關(guān)于志賀氏菌對(duì)喹諾酮藥物耐受機(jī)制的研究。細(xì)菌主要是通過(guò)以下幾個(gè)方式來(lái)降低藥物的殺傷力。第一種機(jī)制是細(xì)菌將編碼DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的基因突變,這些突變?cè)诓桓淖兠富钚缘耐瑫r(shí)增加細(xì)菌對(duì)喹諾酮藥物的耐受。這是細(xì)菌對(duì)喹諾酮藥物耐受的主要機(jī)制。第二種機(jī)制是細(xì)菌內(nèi)出現(xiàn)了一些耐藥性質(zhì)粒,這些質(zhì)粒能夠編碼一些能夠降低藥物與DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV結(jié)合能力的蛋白,有些還可以編碼與細(xì)菌外排泵相關(guān)的蛋白,使細(xì)菌主動(dòng)將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到體外。這種耐藥機(jī)制是可以隨著遺傳物質(zhì)的復(fù)制時(shí)遺傳給下一代的。第三種是細(xì)菌染色體調(diào)節(jié)的對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物耐受的機(jī)制。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌染色體上的一些基因可以調(diào)節(jié)細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白通道上的孔蛋白,從而增加菌對(duì)藥物的耐受性。首先,我們測(cè)定了氟喹諾酮類(lèi)藥物氧氟沙星對(duì)Shigella flexneri 2a 301野生株,突變株△Osp F,以及回補(bǔ)株的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC),發(fā)現(xiàn)突變株△Osp F相比其余兩個(gè)菌株對(duì)氧氟沙星藥物出現(xiàn)了明顯的耐受現(xiàn)象。隨后我們又檢測(cè)了莫西沙星,環(huán)丙沙星,諾氟沙星,萘啶酸這些氟喹諾酮藥物對(duì)這三株菌的MIC,發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的情況,因此我們想要探究志賀氏菌△Osp F突變株對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物的耐受是怎樣進(jìn)行調(diào)控的。在初步發(fā)現(xiàn)突變株△Osp F對(duì)氟喹諾酮藥物耐受這一現(xiàn)象后,我們隨后采用不同濃度梯度的氟喹諾酮類(lèi)藥物處理這三株菌株,記錄菌株在藥物處理一定時(shí)間后的菌落形成單位(colony-forming unit,CFU),并計(jì)算存活率制作殺菌曲線,驗(yàn)證突變株△Osp F對(duì)氟喹諾酮藥物的耐受表型。最后以過(guò)氧化氧(hydrogen peroxide,H202)處理以及厭氧環(huán)境培養(yǎng)菌株,來(lái)研究過(guò)氧化氫對(duì)志賀氏菌野生株和突變株的脅迫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:志賀氏菌突變株△Osp F在經(jīng)過(guò)莫西沙星,環(huán)丙沙星,諾氟沙星,環(huán)丙沙星,氧氟沙星,萘啶酸處理后,表現(xiàn)出對(duì)這些藥物的耐受表型。我們通過(guò)Western-blot以及PCR,證明了突變株以及回補(bǔ)株的成功構(gòu)建。并且Western-blot驗(yàn)證了Osp F蛋白重組表達(dá)成功的回補(bǔ)株與野生型菌株一樣對(duì)這些藥物表現(xiàn)出了敏感表型。在雙氧水耐受水平上,突變株△Osp F在較高濃度的雙氧水處理下比野生型菌株表現(xiàn)出了一定程度的耐受現(xiàn)象。并且在加了一定濃度的硫脲和2,2聯(lián)吡啶試劑后,能消除掉一定濃度的環(huán)丙沙星對(duì)野生型和突變株△Osp F引起的殺菌作用。我們?cè)趨捬鯒l件下,測(cè)定環(huán)丙沙星以及莫西沙星對(duì)野生型以及突變株的殺菌作用時(shí),存活率比有氧條件下的存活要高。說(shuō)明,活性氧的聚集能夠增加這些抗生素對(duì)志賀氏菌的殺菌效果,△Osp F突變株,能夠通過(guò)活性氧途徑,增加其菌株在相關(guān)致死因子脅迫下的存活率。因此,本研究證明了志賀氏菌效應(yīng)蛋白Osp F能夠通過(guò)氧化壓力這條途徑來(lái)調(diào)控志賀氏菌對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物的敏感現(xiàn)象。
【關(guān)鍵詞】：志賀氏菌 氟喹諾酮類(lèi)藥物 抗生素耐受 OspF 效應(yīng)蛋白
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R378
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 第1章 綜述13-25
• 1.1 志賀氏菌的簡(jiǎn)介13-19
• 1.1.1 志賀氏菌的分類(lèi)及其基本特征13
• 1.1.2 志賀氏菌的致病機(jī)理13-16
• 1.1.3 三型分泌系統(tǒng)16-18
• 1.1.4 宿主的天然免疫系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌入侵的應(yīng)激反應(yīng)18-19
• 1.2 氟喹諾酮類(lèi)藥物發(fā)展歷程及作用機(jī)制19-22
• 1.2.1 氟喹諾酮類(lèi)藥物的發(fā)展歷程19
• 1.2.2 氟喹諾酮類(lèi)藥物的主要靶點(diǎn)19-20
• 1.2.3 斷裂復(fù)合體的形成與喹諾酮類(lèi)藥物的殺菌效果20-21
• 1.2.4 染色體片段化對(duì)細(xì)菌的殺菌效果21
• 1.2.5 活性氧與殺菌效果間的關(guān)聯(lián)21-22
• 1.3 耐藥機(jī)制22-23
• 1.3.1 靶標(biāo)介導(dǎo)的喹諾酮耐藥22
• 1.3.2 質(zhì)粒調(diào)節(jié)的喹諾酮耐藥22-23
• 1.3.3 染色體調(diào)節(jié)的喹諾酮耐藥23
• 1.4 志賀氏菌效應(yīng)蛋白OspF23-25
• 第2章 前言25-27
• 2.1 研究目的及意義25
• 2.2 研究?jī)?nèi)容與技術(shù)路線25-27
• 第3章 材料與方法27-41
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料27-31
• 3.1.1 菌株和質(zhì)粒27
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑27-28
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器28-29
• 3.1.4 主要培養(yǎng)基和溶液的配制29-31
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法31-41
• 3.2.1 志賀氏菌OspF基因PCR引物設(shè)計(jì)與合成31
• 3.2.2 OspF基因的鑒定31
• 3.2.3 PCR產(chǎn)物凝膠回收31-32
• 3.2.4 OspF基因連接到Pet21a載體上，并轉(zhuǎn)化到Top10感受態(tài)中。32-33
• 3.2.5 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化33-34
• 3.2.6 質(zhì)粒提取步驟34-35
• 3.2.7 Pet21a OspF重組菌菌液制備35
• 3.2.8 OspF蛋白的純化35-36
• 3.2.9 Shigella flexneri 2a 301野生株，突變株以及回補(bǔ)株中OspF蛋白的鑒定36-37
• 3.2.10 OspF抗體的制備37
• 3.2.11 OspF抗體的純化37-38
• 3.2.12 抗體效價(jià)的檢驗(yàn)38
• 3.2.13 MIC測(cè)定38-39
• 3.2.14 檢測(cè)Shigella flexneri 2a 301野生株，突變株以及回補(bǔ)株中對(duì)氟諾酮類(lèi)藥物的敏感性39
• 3.2.15 在一定濃度氟喹諾酮類(lèi)藥物的處理下，Shigella flexneri 2a 301野生株，，突變株以及回補(bǔ)株存活率的測(cè)定39
• 3.2.16 雙氧水耐受測(cè)試39-40
• 3.2.17 硫脲，2,2 聯(lián)吡啶對(duì)藥物殺菌作用的影響40
• 3.2.18 厭氧環(huán)境對(duì)藥物殺菌作用的影響40
• 3.2.19 細(xì)菌體內(nèi)活性氧的檢測(cè)40-41
• 第4章 結(jié)果與分析41-57
• 4.1 OspF基因的PCR擴(kuò)增鑒定41-42
• 4.2 OspF蛋白的純化，以及抗體的制備與純化42-43
• 4.3 Western-blot檢測(cè)OspF基因在Shigella flexneri 2a 301野生株、△OspF突變株以及回補(bǔ)株中的表達(dá)43-44
• 4.4 生長(zhǎng)速率的測(cè)定44-45
• 4.5 最小抑菌濃度的測(cè)定45-46
• 4.6 驗(yàn)證突變株的耐受表型46
• 4.7 在單一藥物處理下存活率的測(cè)定46-50
• 4.8 志賀氏菌對(duì)雙氧水耐受測(cè)試50
• 4.9 2,2 聯(lián)吡啶與硫脲對(duì)抗生素殺菌作用的影響50-51
• 4.10 厭氧條件對(duì)抗生素殺菌效果的影響51-55
• 4.11 環(huán)丙沙星處理下，志賀氏菌內(nèi)活性氧的變化55-57
• 第5章 討論與展望57-60
• 5.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)論57
• 5.2 討論57-58
• 5.3 展望58-60
• 參考文獻(xiàn)60-70
• 致謝70-72
• 在校期間發(fā)表論文72

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4 王}

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