本文關(guān)鍵詞：PNPase對銅綠假單胞菌毒力以及sRNA穩(wěn)定性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：銅綠假單胞菌是一種適應(yīng)性強(qiáng)代謝通路復(fù)雜的革蘭氏陰性菌。作為一種條件致病菌。銅綠假單胞菌具有多種毒力因子,可以引起急性感染和慢性感染兩種感染類型。在急性感染中,三型分泌系統(tǒng)(T3SS)和運(yùn)動(dòng)能力發(fā)揮著重要的作用。而在慢性感染過程中,生物被膜可以保護(hù)細(xì)菌受到宿主免疫系統(tǒng)的清除。另外,高水平的六型分泌系統(tǒng)(T6SS)的表達(dá)是慢性感染的一個(gè)明顯特征。在銅綠假單胞菌中,存在兩個(gè)小RNA,RsmY和RsmZ(RsmY/Z),會(huì)競爭性調(diào)節(jié)急性感染以及慢性感染的毒力因子。多核苷酸磷酸化酶(PNPase)是由N端的核心功能區(qū)以及C端的RNA結(jié)合區(qū)KH-S1組成。迄今,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PNPase主要通過三種方式來控制基因的表達(dá):降解mRNA,影響sRNA穩(wěn)定性以及影響翻譯。在前期的研究中,我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子插入到pnp基因會(huì)引起銅綠假單胞菌T3SS表達(dá)的缺失。本項(xiàng)工作深入探究了PNPase調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)理。首先,我們驗(yàn)證了PNPase的KH-S1區(qū)對于T3SS以及細(xì)菌毒力是必須的。接著我們進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序,發(fā)現(xiàn)PNPase在基因調(diào)控上具有多種功能。值得注意的是,在ΔKH-S1菌株中,我們發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)因子exsA的RNA水平有明顯的降低,進(jìn)而影響了三型分泌系統(tǒng)的表達(dá)。在ΔKH-S1中,我們發(fā)現(xiàn)四型菌毛水平的降低以及T6SS的上調(diào)均是由RsmY/Z水平的升高引起的。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明,敲除KH-S1也不會(huì)影響RsmY/Z的轉(zhuǎn)錄,但是會(huì)增加了sRNA的穩(wěn)定性。菌體內(nèi)的RNA富集以及體外的EMSA實(shí)驗(yàn)均證明了,KH-S1片段和RsmY/Z有直接的結(jié)合作用。綜上所述,我們的研究表明,PNPase對于調(diào)控銅綠假單胞菌毒力以及控制sRNA的穩(wěn)定性具有重要的作用。
【關(guān)鍵詞】：PNPase 毒力 RsmY/Z 穩(wěn)定性
【學(xué)位授予單位】：南開大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 前言9-22
• 第一節(jié) 銅綠假單胞菌的生物特性以及毒力因子10-15
• 1.1.1 銅綠假單胞菌的生物特性10-11
• 1.1.2 銅綠假單胞菌的毒力因子11-13
• 1.1.3 三型分泌系統(tǒng)（T3SS）與六型分泌系統(tǒng)（T6SS）13-15
• 第二節(jié) 銅綠假單胞菌毒力因子的調(diào)控15-17
• 1.2.1 Gac/Rsm通路（雙組份系統(tǒng)）15-16
• 1.2.2 銅綠假單胞菌中的調(diào)控sRNA16-17
• 第三節(jié) 多核苷酸磷酸化酶（Polynucleotide phosphorylase, PNPase）17-20
• 1.3.1 PNPase的結(jié)構(gòu)與功能單位17-18
• 1.3.2 PNPase的研究現(xiàn)狀18-20
• 第四節(jié) 本文研究目的意義以及技術(shù)線路20-22
• 1.4.1 本文研究目的意義20-21
• 1.4.2 本文研究的技術(shù)線路21-22
• 第二章 材料與方法22-45
• 第一節(jié) 材料與試劑22-27
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株與質(zhì)粒22-24
• 2.1.2 RT-PCR引物序列24-25
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器25-27
• 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法27-45
• 2.2.1.微量質(zhì)粒的提取27
• 2.2.2.細(xì)菌基因組的提取27-28
• 2.2.3.PCR，，特異性片段擴(kuò)增28-29
• 2.2.4. 酶切和連接體系29-30
• 2.2.5. E.coli化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化30
• 2.2.6. 銅綠假單胞菌轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化30-31
• 2.2.7.β-半乳糖苷酶活性的測定31
• 2.2.8.敲除菌株的構(gòu)建31-33
• 2.2.9.Western blot33-34
• 2.2.10 細(xì)菌RNA提取34-35
• 2.2.11 RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA35-36
• 2.2.12 Real-Time PCR36-37
• 2.2.13 點(diǎn)突變菌株的構(gòu)建37-38
• 2.2.14 免疫共沉淀38-39
• 2.2.15 細(xì)胞毒性檢測39
• 2.2.16 小鼠肺部急性感染模型39-40
• 2.2.17 蛋白純化40-41
• 2.2.18 RNA的體外轉(zhuǎn)錄41-42
• 2.2.19 RNA EMSA實(shí)驗(yàn)42-43
• 2.2.20 RNA穩(wěn)定性分析43
• 2.2.21 蹭行運(yùn)動(dòng)檢測（Twitching motility）43-44
• 2.2.22 細(xì)菌的最低抑菌濃度（MIC）的測定44-45
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析討論45-67
• 第一節(jié) pnp是銅綠假單胞菌的必需基因45-48
• 3.1.1 pnp是銅綠假單胞菌的必需基因45-46
• 3.1.2 pnp缺失菌株的構(gòu)建46-48
• 第二節(jié) PNPase影響銅綠假單胞菌三型分泌系統(tǒng)及急性感染48-53
• 3.2.1 PNPase會(huì)影響三型分泌系統(tǒng)的表達(dá)48
• 3.2.2 PNPase影響銅綠假單胞菌細(xì)胞毒性以及小鼠肺部定植48-50
• 3.2.3 PNPase的KH和S1結(jié)構(gòu)域?qū)τ诙玖Φ挠绊?/span>50-52
• 3.2.4 exsA的過表達(dá)可以回補(bǔ)T3SS的缺失52-53
• 第三節(jié) PNPase影響多個(gè)基因的表達(dá)53-56
• 第四節(jié) 銅綠假單胞菌多種毒力因子的變化56-59
• 3.4.1 PNPase影響銅綠假單胞菌的蹭行能力56
• 3.4.2 PNPase影響銅綠假單胞菌的六型分泌系統(tǒng)T6SS56-59
• 第五節(jié) PNPase通過影響sRNA進(jìn)一步調(diào)控毒力因子59-62
• 3.5.1 Gac-Rsm雙組份系統(tǒng)的表達(dá)變化59-60
• 3.5.2 sRNA RsmY/Z的表達(dá)水平以及作用60-62
• 第六節(jié) PNPase會(huì)直接作用于sRNA62-67
• 3.6.1 PNPase影響sRNA RsmY/Z的穩(wěn)定性62-64
• 3.6.2 PNPase可以和sRNA RsmY/Z直接結(jié)合64-67
• 第四章 結(jié)論與討論67-69
• 參考文獻(xiàn)69-76
• 致謝76-77
• 個(gè)人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與科研成果77

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