本文關(guān)鍵詞：重組人肝活素（HPS）的受體分離和確認(rèn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肝活素(hepassocin,HPS),又名肝細(xì)胞衍生纖維蛋白原相關(guān)蛋白1(Hepatocyte-derived Fibrinogen-Related Protein 1)或類纖維蛋白原1(Fibrinogen-Like 1,FGL1),是一種肝臟特異性的促有絲分裂因子,并在肝部分切除、四氯化碳(CCl4)、D-氨基半乳糖(D-galN)等誘導(dǎo)的肝損傷修復(fù)中起重要作用。我們前期的研究表明HPS以表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)依賴方式激活MAPK信號(hào)通路并介導(dǎo)促進(jìn)正常肝細(xì)胞增殖作用,但有關(guān)是否存在HPS特異受體及其受體分子還知之甚少。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備重組HPS的基礎(chǔ)上,建立了重組人HPS體外生物學(xué)活性測(cè)定方法,證實(shí)獲得高活性的重組HPS。進(jìn)而采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)和受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)肝源細(xì)胞存在HPS特異受體。采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)我們發(fā)現(xiàn)ANXA2分子是HPS受體候選分子,進(jìn)一步我們通過(guò)多種方法證實(shí)ANXA2分子參與HPS膜信號(hào)的傳遞,表明ANXA2分子至少是HPS受體成分之一。這些研究結(jié)果為研究HPS介導(dǎo)的信號(hào)途徑及其在嚴(yán)重肝病治療中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。前期實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建了CHO-HPS表達(dá)細(xì)胞系,并獲得多批次HPS樣品,本研究驗(yàn)證了重組HPS的理化性質(zhì)和純度,證實(shí)獲得高純度HPS。進(jìn)一步,我們通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,建立了基于EdU摻入的促肝細(xì)胞增殖及基于乳酸脫氫酶釋放的肝細(xì)胞保護(hù)兩種體外HPS生物活性檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組HPS以劑量依賴方式促進(jìn)肝細(xì)胞增殖,抑制CCl4誘導(dǎo)的乳酸脫氫酶釋放,表明我們獲得了高純度高活性的重組HPS,可用于HPS受體及其信號(hào)途徑和HPS功能等研究。這兩種方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好,較好地反映了HPS體內(nèi)通過(guò)促進(jìn)肝細(xì)胞增殖、抑制肝細(xì)胞壞死救治急性肝損傷小鼠的活性,可用于重組HPS體外生物學(xué)活性的評(píng)價(jià),為重組HPS質(zhì)量控制和研究HPS的功能奠定基礎(chǔ)。為證實(shí)細(xì)胞膜上是否存在HPS特異受體,我們首先采用FITC熒光標(biāo)記HPS,并通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察HPS是否能與肝細(xì)胞膜結(jié)合,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FITC標(biāo)記的HPS可特異結(jié)合在L02肝細(xì)胞膜部位,提示L02細(xì)胞存在HPS特異結(jié)合受體。為驗(yàn)證這一結(jié)果,我們采用經(jīng)典的碘標(biāo)法標(biāo)記HPS,體外生物活性檢測(cè)表明125I-標(biāo)記的HPS保持了促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的活性,提示I-標(biāo)記沒(méi)有破壞HPS的空間結(jié)構(gòu)。受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPS與L02人肝細(xì)胞、HepG2人肝癌細(xì)胞及小鼠原代肝細(xì)胞的結(jié)合呈現(xiàn)典型的受體與配體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)方式,L02細(xì)胞的飽和濃度為1546.32ng/mL,HepG2細(xì)胞的飽和濃度為2753.84ng/m L,小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的飽和濃度為2242.76ng/ml。l02細(xì)胞、hepg2細(xì)胞、小鼠原代肝細(xì)胞表面hps受體數(shù)目分別為3.1×105sites/cell、1.8×105sites/cell和4.8×105sites/cell。小鼠原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞受體數(shù)量較多,可能與該細(xì)胞體積比較大有關(guān)。scatchard分析結(jié)果顯示,三種肝源細(xì)胞只存在一種hps受體。hps與l02細(xì)胞、hepg2細(xì)胞、小鼠原代肝細(xì)胞的結(jié)合常數(shù)依次為6.71pmol/l、7.7nmol/l和2.17nmol/l。競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)表明,高倍濃度非標(biāo)的hps能夠有效競(jìng)爭(zhēng)125i-hps與細(xì)胞的結(jié)合,符合受體配體間的競(jìng)爭(zhēng)曲線。這些結(jié)果表明上述肝源細(xì)胞存在hps特異膜受體。檢測(cè)125i-hps與非肝源細(xì)胞a549、hela、ea926細(xì)胞的結(jié)合發(fā)現(xiàn),hps與受體的結(jié)合具有肝特異性。用高濃度egf、hgf不能競(jìng)爭(zhēng)hps與肝細(xì)胞的結(jié)合,說(shuō)明hps受體不同于egf和hgf受體。進(jìn)一步,我們用配體與受體交聯(lián)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)hps特異受體的存在。放射自顯影結(jié)果表明125i-hps與受體形成的復(fù)合體大小約為110kd,已知hps的單體去除n端信號(hào)肽后分子量為34kd,二聚體是其發(fā)揮活性的構(gòu)象,分子量大小為68kd,因此推測(cè)hps受體的分子量約為42kd。為確認(rèn)hps的受體分子,我們采用蛋白質(zhì)組技術(shù)鑒定了hps刺激后細(xì)胞膜蛋白質(zhì)磷酸化的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)hps刺激l02細(xì)胞顯著誘導(dǎo)40kd左右的酪氨酸磷酸化蛋白帶,對(duì)這一條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,得到4個(gè)候選蛋白,通過(guò)對(duì)候選蛋白質(zhì)組織分布、細(xì)胞定位、功能分析等綜合判斷,我們推測(cè)anxa2分子可能為hps的受體。進(jìn)一步,我們驗(yàn)證了hps可誘導(dǎo)anxa2發(fā)生酪氨酸磷酸化,hps可與anxa2在細(xì)胞膜共定位并發(fā)生相互作用;采用rna干涉下調(diào)anxa2表達(dá),顯著降低125i-hps與l02細(xì)胞的結(jié)合;下調(diào)anxa2表達(dá)抑制了hps誘導(dǎo)的egfr磷酸化和mapk通路的活化,并抑制了hps促進(jìn)l02細(xì)胞增殖和降低ccl4誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的活性。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明anxa2是hps信號(hào)通路的關(guān)鍵分子,參與了hps與肝源細(xì)胞的結(jié)合過(guò)程,是hps受體或者至少是hps受體的組成部分。我們還通過(guò)同源建模的方法建立了hps的三維結(jié)構(gòu),通過(guò)對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化,最終建立了一個(gè)高質(zhì)量的hps三維結(jié)構(gòu)模型。將此模型與anxa2進(jìn)行剛性對(duì)接,并結(jié)合構(gòu)型進(jìn)行多重優(yōu)化,獲得hps與anxa2最佳的結(jié)合構(gòu)型。anxa2與hps相互作用的殘基為:phe72、gln69、met11。與之對(duì)應(yīng)的hps作用的殘基為:glu59、leu55、lys65。hps受體的確認(rèn)對(duì)闡明hps信號(hào)通路、功能及在嚴(yán)重肝病治療中的作用等多個(gè)方面具有重要意義,同時(shí),hps受體也可能成為肝臟疾病的靶點(diǎn),用于新藥的研發(fā)。雖然本實(shí)驗(yàn)初步確認(rèn)anxa2參與hps與細(xì)胞結(jié)合的過(guò)程,但anxa2缺乏嚴(yán)格的肝組織特異性,不能從組織分布的角度解釋hps特異促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的作用機(jī)制,此外,我們前期的研究表明HPS刺激肝細(xì)胞增殖依賴于EGFR的活化,ANXA2已被報(bào)道可與EGFR發(fā)生相互作用并調(diào)控其活化,因此,下一步我們需要研究HPS-ANXA2-EGFR-MAPK在HPS信號(hào)通路及生物學(xué)功能中的作用,特別是肝臟特異選擇的作用機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：肝活素 膜連蛋白 放射性碘 受體研究
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-16
• 第一章 材料與方法16-26
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑16
• 1.1.1 細(xì)胞系16
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物16
• 1.1.3 主要試劑16
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法16-26
• 1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)條件16-17
• 1.2.2 HPS體外活性方法測(cè)定的建立17-18
• 1.2.3 FITC熒光標(biāo)記重組人肝活素HPS18
• 1.2.4 FITC-HPS與L02細(xì)胞的結(jié)合18
• 1.2.5 125I標(biāo)記HPS18
• 1.2.6 受體飽和實(shí)驗(yàn)18-19
• 1.2.7 受體競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)19
• 1.2.8 小鼠原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的分離19
• 1.2.9 BS3交聯(lián)法19
• 1.2.10 125I放射自顯影19-20
• 1.2.11 EGF、HGF與 125I-HPS競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)20
• 1.2.12 細(xì)胞膜蛋白提取20
• 1.2.13 細(xì)胞總蛋白提取20-21
• 1.2.14 免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western Blot）21
• 1.2.15 免疫共沉淀（CoIP）21
• 1.2.16 RNA提取及Real time PCR檢測(cè)21-22
• 1.2.17 細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染22
• 1.2.18 小RNA轉(zhuǎn)染22
• 1.2.19 間接免疫（熒光共聚焦）22
• 1.2.20 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析22
• 1.2.21 HPS的同源建模22-24
• 1.2.22 HPS與ANXA2的對(duì)接研究24
• 1.2.23 模型優(yōu)化及分子動(dòng)力學(xué)模擬24
• 1.2.24 丙氨酸突變掃描24-26
• 第二章 結(jié)果與討論26-62
• 2.1 重組人肝活素（HPS）的鑒定26-33
• 2.1.1 重組人肝活素（HPS）的理化性質(zhì)及純度鑒定26-27
• 2.1.2 重組人肝活素（HPS）的生物學(xué)活性鑒定27-33
• 2.2 重組人肝活素（HPS）肝源性細(xì)胞特異受體的鑒定33-59
• 2.2.1 重組人肝活素（HPS）存在肝源性細(xì)胞特異性受體33-42
• 2.2.2 重組人肝活素（HPS）受體鑒定42-48
• 2.2.3 重組人肝活素（HPS）通過(guò)ANXA2發(fā)揮生物學(xué)功能48-51
• 2.2.4 HPS與ANXA2在膜上共定位51-52
• 2.2.5 HPS與ANXA2存在相互作用52-53
• 2.2.6 生物信息學(xué)模擬HPS與ANXA2相互作用53-59
• 2.3 討論59-62
• 總結(jié)62-63
• 一、主要研究成果62
• 二、論文創(chuàng)新點(diǎn)62
• 三、下一步工作計(jì)劃62-63
• 附錄63-75
• 一、英文縮略詞表63-64
• 二、主要儀器設(shè)備64-65
• 三、常用試劑、培養(yǎng)基的配制65-67
• 三、SDS-PAGE進(jìn)行分子量的測(cè)定分析67
• 四、電噴霧質(zhì)譜蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定分析67-68
• 五、固相pH梯度（ IPG）等電聚焦法(Bio-Rad手冊(cè))68
• 六、氨基酸序列分析方法（ OPA法）68-70
• 七、Edman降解蛋白質(zhì)N-末端氨基酸序列分析方法70-71
• 八、C-末端氨基酸序列分析（ 質(zhì)譜法）71-73
• 九、二硫鍵定性分析73-75
• 參考文獻(xiàn)75-80
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷80-81
• 致謝81

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本文編號(hào)：434308