本文關(guān)鍵詞：低氧損傷下PC12細(xì)胞自噬與凋亡的關(guān)系研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分低氧損傷誘導(dǎo)PC12細(xì)胞自噬激活目的初步探討在低氧損傷下神經(jīng)元樣腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12細(xì)胞)自噬的發(fā)生情況。方法通過(guò)低氧培養(yǎng)箱建立細(xì)胞低氧損傷模型;構(gòu)建GFP-LC3質(zhì)粒;分別在給予或者不給予溶酶體質(zhì)子泵抑制劑Baf A1的情況下,通過(guò)western blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá);RT-PCR法檢測(cè)自噬小體表面微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)m RNA水平的表達(dá);激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)LC3的表達(dá)及分布變化。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析低氧損傷與細(xì)胞自噬之間的關(guān)系。結(jié)果western blot結(jié)果顯示,低氧損傷下,PC12細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)明顯隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,24小時(shí)后出現(xiàn)下降;RT-PCR結(jié)果顯示,低氧損傷下,LC3的m RNA水平明顯上調(diào);激光共聚焦顯微鏡檢查結(jié)果顯示,低氧損傷下,細(xì)胞內(nèi)含有GFP-LC3顆粒的自噬小體明顯增多。自噬的發(fā)生與低氧損傷之間存在相關(guān)性。結(jié)論低氧損傷能誘導(dǎo)PC12細(xì)胞發(fā)生自噬,兩者之間存在相關(guān)性。第二部分自噬激活在低氧損傷中的作用及其機(jī)制目的以對(duì)低氧敏感的神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞為低氧損傷模型,探討低氧誘導(dǎo)的自噬激活在低氧損傷中發(fā)揮的作用及其機(jī)制。方法通過(guò)低氧培養(yǎng)箱建立細(xì)胞低氧損傷模型;體外給予細(xì)胞自噬抑制劑3-MA,通過(guò)MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活力;LDH法檢測(cè)細(xì)胞毒性;PI染色檢測(cè)細(xì)胞死亡情況;caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)caspase-3的活性;western blot方法檢測(cè)caspase-3的活性形式cleaved caspase-3的表達(dá)變化。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析低氧損傷下抑制細(xì)胞自噬后細(xì)胞活力及凋亡變化及其相關(guān)性。結(jié)果MTT結(jié)果顯示給予自噬抑制劑3-MA后,低氧損傷的細(xì)胞活力進(jìn)一步降低;LDH結(jié)果顯示給予自噬抑制劑3-MA后,低氧損傷的細(xì)胞細(xì)胞毒性進(jìn)一步增強(qiáng);PI染色結(jié)果顯示給予自噬抑制劑3-MA后,低氧損傷的細(xì)胞死亡進(jìn)一步增多;并且caspase-3的活性及活性形式表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示,給予自噬抑制劑3-MA后,caspase-3的活性增強(qiáng),其活性表達(dá)形式cleaved caspase-3的表達(dá)增多。結(jié)論低氧損傷下,自噬發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用,這種保護(hù)作用可能與抑制凋亡有關(guān)。第三部分凋亡抑制自噬活動(dòng)目的低氧損傷24小時(shí)后自噬活動(dòng)逐漸減弱,而凋亡活動(dòng)逐漸增強(qiáng)。凋亡對(duì)自噬是否影響及其可能的機(jī)制尚不完全明了。本研究目的是初步探討低氧損傷的后期凋亡的增強(qiáng)是否導(dǎo)致自噬的減弱,兩者之間是否存在相關(guān)性。方法通過(guò)低氧培養(yǎng)箱建立細(xì)胞低氧損傷模型;構(gòu)建Flag-Bax WT,Flag-Bax S184V和Flag-BaxΔC過(guò)表達(dá)質(zhì)粒;將EGFP-LC3分別與Flag-Bax WT(或Flag-Bax S184V,Flag-BaxΔC)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的變化;給予細(xì)胞凋亡抑制劑z-VAD-FMK,蛋白酶體抑制劑MG132和溶酶體抑制劑氯喹,western blot檢測(cè)共轉(zhuǎn)細(xì)胞內(nèi)LC3表達(dá)的變化;細(xì)胞低氧時(shí)給予細(xì)胞凋亡抑制劑z-VAD-FMK,western blot檢測(cè)LC3表達(dá)的變化。結(jié)果western blot結(jié)果顯示,當(dāng)EGFP-LC3與野生型Flag-Bax WT或激活性Flag-Bax S184V質(zhì)粒共轉(zhuǎn)時(shí)其表達(dá)明顯減少,而與突變型Flag-BaxΔC質(zhì)粒共轉(zhuǎn)則沒(méi)有此現(xiàn)象;給予凋亡抑制劑z-VAD-FMK能部分逆轉(zhuǎn)野生型Flag-Bax WT(或Flag-Bax S184V)過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的LC3表達(dá)減少的情況;細(xì)胞低氧時(shí)給予細(xì)胞凋亡抑制劑z VAD,能抑制LC3表達(dá)的減少。結(jié)論低氧24小時(shí)后凋亡激活能抑制自噬功能,過(guò)表達(dá)Bax誘導(dǎo)的凋亡能抑制自噬功能,可能與caspase降解LC3蛋白有關(guān),兩者之間存在相關(guān)性。
【關(guān)鍵詞】：PC12細(xì)胞 低氧 自噬 自噬 保護(hù) 凋亡 自噬 凋亡 caspase
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-14
• 中英文縮寫索引14-16
• 緒論16-19
• 第一部分 低氧損傷誘導(dǎo)PC12細(xì)胞自噬激活19-40
• 引言19-20
• 1 材料與方法20-32
• 2 結(jié)果32-37
• 3 討論37-39
• 4 結(jié)論39-40
• 第二部分 自噬激活在低氧損傷中的作用及其機(jī)制40-51
• 引言40
• 1 材料與方法40-44
• 2 結(jié)果44-49
• 3 討論49-50
• 4 結(jié)論50-51
• 第三部分 凋亡抑制自噬活動(dòng)51-59
• 引言51
• 1 材料與方法51-54
• 2 結(jié)果54-57
• 3 討論57-58
• 4 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-64
• 致謝64-66
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文66

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：低氧損傷下PC12細(xì)胞自噬與凋亡的關(guān)系研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：429435