本文關(guān)鍵詞：多種載體蛋白對TNFα免疫原性影響的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)是一種可以殺傷某些腫瘤細(xì)胞使腫瘤出血性壞死但不殺傷正常組織細(xì)胞的細(xì)胞因子。它可以介導(dǎo)多種免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)和炎癥反應(yīng),是近年來抗癌藥物研究的一個重要靶點。當(dāng)腫瘤壞死因子過量表達(dá)時,它會引發(fā)如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、惡液質(zhì)、感染性疾病等諸多疾病。那么控制體內(nèi)TNFα表達(dá)的量是治療上述疾病的關(guān)鍵。目前已有五種TNF-α單克隆抗體上市并在臨床上取得了一定的效果。但是,這些單克隆抗體需要反復(fù)長期使用,用藥劑量大,增加了細(xì)菌、結(jié)核等的感染風(fēng)險。同時,這些藥物的昂貴藥價也使該種類的藥物不能廣泛應(yīng)用。據(jù)統(tǒng)計,臨床上接受TNFα單克隆抗體藥物治療的患者平均每年的花費超過2萬美元,這樣昂貴的醫(yī)藥費令許多患者望而卻步。而疫苗既可誘導(dǎo)機(jī)體自身產(chǎn)生抗體,使用劑量又小,不需長期反復(fù)使用,避免了感染的風(fēng)險也克服了易引發(fā)超敏反應(yīng)的缺陷,因此靶向TNF-α的疫苗有著廣闊的前景。TNF-Kinoid疫苗是人的TNF和KLH經(jīng)過戊二醛化學(xué)偶聯(lián),并用甲醛對TNF生物活性進(jìn)行滅活的蛋白化學(xué)偶聯(lián)疫苗。經(jīng)過十年的研發(fā),在小鼠體內(nèi)可以產(chǎn)生很好的免疫反應(yīng),并且有良好效果的中和抗體產(chǎn)生。2014年臨床II期結(jié)果并沒有取得良好的效果,分析原因可能是因為放大的疫苗滅毒工藝改變了其分子空間構(gòu)象,破壞了疫苗的抗原性,使其沒有產(chǎn)生針對TNF的中和抗體。TNFα由于具有生物活性,所以直接用于疫苗,會對人體產(chǎn)生一定的毒副作用,所以本實驗室前期經(jīng)過點突變的篩選,篩選到TNFY119N(簡寫為h TNFαmut)使其活性大大降低,利用這個點突變蛋白再與不同的載體蛋白化學(xué)偶聯(lián),考察不同載體蛋白對h TNFαmut免疫原性的影響。本研究將TNF-α作為靶點,利用同源重組的方法將h TNFαmut分別融合在CTB的氨基端和羧基端,并通過大腸桿菌分泌表達(dá)系統(tǒng)獲得了兩個融合蛋白。利用戊二醛化學(xué)偶聯(lián)的方法制備h TNFαmut與不同載體蛋白的偶聯(lián)蛋白。將制備的重組蛋白和偶聯(lián)蛋白免疫Balb/C小鼠,使用ELISA檢測抗血清中抗體的產(chǎn)生及血清抗體效價。結(jié)果顯示,所有蛋白均能產(chǎn)生抗體且抗體的效價均大于1×105。同時,載體蛋白CTB偶聯(lián)h TNFαmut及CTB-h TNFαmut自身偶聯(lián)的蛋白產(chǎn)生的抗體效價高于對照組,其他載體蛋白偶聯(lián)h TNFαmut產(chǎn)生的抗體效價低于對照組,初步評估霍亂毒素B亞基(CTB)可做為一種較好的載體蛋白來增強(qiáng)h TNFαmut在體內(nèi)的免疫原性。
【關(guān)鍵詞】：腫瘤壞死因子α 載體蛋白 化學(xué)偶聯(lián)
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要4-6
• abstract6-12
• 第一章 緒論12-22
• 1.1 TNFα 的研究進(jìn)展12-13
• 1.1.1 TNFα 的發(fā)現(xiàn)與命名12
• 1.1.2 TNFα 的基因與蛋白結(jié)構(gòu)12-13
• 1.1.3 TNFα 與相關(guān)臨床疾病13
• 1.2 TNFα 在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中作用的研究進(jìn)展13-18
• 1.2.1 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎13-14
• 1.2.2 TNFα 在RA中的作用原理14
• 1.2.3 TNFα 的疫苗的研究進(jìn)展14-15
• 1.2.4 Kinoid免疫原與免疫原的制備15-16
• 1.2.5 Kinoid的抗原性和免疫原性16
• 1.2.6 Kinoid的藥效學(xué)與藥物代謝動力學(xué)16-17
• 1.2.7 Kinoid的安全控制17-18
• 1.3 載體蛋白的研究進(jìn)展18-20
• 1.3.1 白喉毒素DT18-19
• 1.3.2 霍亂毒素B亞基CTB19
• 1.3.3 結(jié)核分枝桿菌蛋白19-20
• 1.4 課題研究思路及技術(shù)路線20-22
• 1.4.1 課題研究的目的及思路20-21
• 1.4.2 課題研究的技術(shù)路線21-22
• 第二章 重組質(zhì)粒CTB-hTNFα~(mut)和hTNFα~(mut)-CTB的構(gòu)建22-36
• 2.1 本章介紹22
• 2.2 實驗材料與儀器22-25
• 2.2.1 實驗試劑22
• 2.2.2 試劑配制22-24
• 2.2.3 實驗儀器24-25
• 2.3 實驗方法25-33
• 2.3.1 融合蛋白的設(shè)計方案25-26
• 2.3.2 引物設(shè)計與合成26
• 2.3.3 目的基因TNFα 的擴(kuò)增26-28
• 2.3.4 pCTB2質(zhì)粒的單酶切與pCTB2質(zhì)粒的雙酶切28-29
• 2.3.5 hTNFα~(mut)-CTB與CTB-hTNFα~(mut)的構(gòu)建29-33
• 2.4 實驗結(jié)果33-35
• 2.4.1 重組蛋白表達(dá)載體設(shè)計33
• 2.4.2 重組質(zhì)粒TNF-hTNFα~(mut)與CTB-hTNFα~(mut)的構(gòu)建33-35
• 2.5 本章小結(jié)35-36
• 第三章 融合蛋白及載體蛋白的純化36-60
• 3.1 本章介紹36
• 3.2 實驗材料36-41
• 3.2.1 實驗材料36-37
• 3.2.2 溶液的配制37-41
• 3.2.3 實驗儀器41
• 3.3 實驗方法41-54
• 3.3.1 hTNFα~(mut)的純化41-46
• 3.3.2 CTB的純化46-49
• 3.3.3 融合蛋白的純化49-50
• 3.3.4 DTT的純化50-52
• 3.3.5 結(jié)核分枝桿菌Rv2991和Rv3607的蛋白純化52-54
• 3.4 實驗結(jié)果54-58
• 3.4.1 目的蛋白純化54-58
• 3.4.2 目標(biāo)蛋白定量58
• 3.5 本章小結(jié)58-60
• 第四章 hTNFα~(mut)與不同載體蛋白化學(xué)偶聯(lián)60-70
• 4.1 本章介紹60
• 4.2 實驗材料60-63
• 4.2.1 藥品與試劑60
• 4.2.2 試劑配制60-62
• 4.2.3 實驗儀器62-63
• 4.3 實驗步驟與方法63-64
• 4.3.1 戊二醛法化學(xué)偶聯(lián)原理63
• 4.3.2 hTNFα~(mut)與Rv2991進(jìn)行二步化學(xué)偶聯(lián)法63-64
• 4.3.3 hTNFα~(mut)與不同載體蛋白進(jìn)行一步化學(xué)交聯(lián)法64
• 4.4 實驗結(jié)果64-68
• 4.4.1 hTNFα~(mut)與Rv2991的二步化學(xué)偶聯(lián)64-65
• 4.4.2 hTNFα~(mut)與不同載體蛋白的一步化學(xué)交聯(lián)65-68
• 4.5 本章小結(jié)68-70
• 第五章 動物免疫及效價測定70-79
• 5.1 本章介紹70
• 5.2 實驗材料與儀器70-72
• 5.2.1 實驗試劑70-71
• 5.2.2 試劑配制71-72
• 5.2.3 主要的實驗儀器72
• 5.3 實驗方法72-75
• 5.3.1 小鼠免疫72-73
• 5.3.2 動物的采血及樣品的處理73
• 5.3.3 ELISA法檢測抗體的產(chǎn)生73-74
• 5.3.4 ELISA法測定血清的效價74-75
• 5.4 實驗結(jié)果75-77
• 5.4.1 ELISA檢測抗體產(chǎn)生75-76
• 5.4.2 ELISA檢測抗體效價76-77
• 5.5 本章小結(jié)77-79
• 全文總結(jié)79-81
• 研究展望81-82
• 參考文獻(xiàn)82-87
• 在校期間科研成果87-88
• 致謝88

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  本文關(guān)鍵詞：多種載體蛋白對TNFα免疫原性影響的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：427462