發(fā)布時(shí)間：2017-06-06 17:20

  本文關(guān)鍵詞：Notch-1信號(hào)通路在缺氧下對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和活化的影響及作用機(jī)制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的新生兒缺氧性腦病是指新生兒在圍產(chǎn)期缺氧而引起的腦組織的缺氧性損害,主要由宮內(nèi)窘迫、新生兒缺氧窒息引起,該疾病多發(fā)生在足月兒,有時(shí)可發(fā)生在早產(chǎn)兒,也可以發(fā)生在由其他因素引發(fā)的腦組織損害。目前已知,新生兒缺氧性腦損害與星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和活化有關(guān)。我們目前的研究發(fā)現(xiàn),在缺氧刺激下,星形膠質(zhì)細(xì)胞大量增殖,細(xì)胞中NICD和Hes-1蛋白表達(dá)增多,推測(cè)這可能與該細(xì)胞中Notch-1因子的激活和表達(dá)上調(diào)有關(guān)。然而,Notch-1在缺氧條件下對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制還不是很清楚。因此,本研究利用wistar新生大鼠構(gòu)建缺氧模型,通過觀察缺氧星形膠質(zhì)細(xì)胞中重要分子表達(dá)的變化,探尋Notch信號(hào)通路在其中可能發(fā)揮的作用,并進(jìn)一步探討Notch-1信號(hào)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和活化的影響及其可能的作用機(jī)制,以期為人類新生兒缺氧性腦損害的臨床防護(hù)與治療提供新途徑。研究方法1.應(yīng)用RT-PCR和蛋白印跡技術(shù)分別檢測(cè)缺氧星形膠質(zhì)細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)和正常氧含量星形膠質(zhì)細(xì)胞(對(duì)照組)中Notch-1 mRNA、 Notch-1蛋白、NICD蛋白、Hes-1mRNA、Hes-1蛋白的表達(dá)量,抑制Notch信號(hào)通路后,觀察Hes-1 mRNA、Hes-1蛋白表達(dá)量的變化。2.應(yīng)用BrdU技術(shù)檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞增殖,探索Notch信號(hào)通路在其中發(fā)揮的作用。3.應(yīng)用RT-PCR技術(shù)觀測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α和IL-1 β等炎性因子的變化,探討Notch信號(hào)通路對(duì)這些因子表達(dá)的影響。4.應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP mRNA、VEGF mRNA的表達(dá),利用蛋白印跡法、ELISA、免疫熒光等技術(shù)檢測(cè)GFAP、 VEGF蛋白的表達(dá)情況,探討抑制Notch信號(hào)通路對(duì)缺氧的星形膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP和VEGF表達(dá)的影響。5.應(yīng)用蛋白印跡法、ELISA、siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)觀察VEGF和NF-κB的表達(dá)情況,探討缺氧下NF-κ B和VEGF通路對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和活化的影響。研究結(jié)果1.在缺氧刺激下,星形膠質(zhì)細(xì)胞中的Notch信號(hào)通路的變化。為了確定在低氧刺激下Notch-1信號(hào)是否被活化,我們通過RT-PCR、免疫熒光等技術(shù)檢測(cè)Notch-1基因在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)量,利用蛋白質(zhì)印記法檢測(cè)Notch-1這種蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,低氧刺激下,Notch-1的mRNA表達(dá)明顯增高。免疫熒光結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,低氧環(huán)境下星形膠質(zhì)細(xì)胞中的Notch-1明顯增加。蛋白質(zhì)印記法顯示,低氧環(huán)境下Notch-1蛋白的表達(dá)也增多了。由于Notch-1表達(dá)的升高,我們進(jìn)一步探索低氧處理過的星形膠質(zhì)細(xì)胞中Notch信號(hào)通路的活化情況。結(jié)果顯示,12hH寸,與對(duì)照組相比,低氧星形膠質(zhì)細(xì)胞中NICD蛋白表達(dá)增多。通過免疫熒光的結(jié)果可以看出,低氧下NICD在星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中(尤其是細(xì)胞核中)的熒光強(qiáng)度比對(duì)照組強(qiáng)。低氧下6h、12h時(shí),星形膠質(zhì)細(xì)胞中Hes-1 mRNA、Hes-1蛋白的表達(dá)升高,用DAPT處理后,其表達(dá)受抑制。2. DAPT對(duì)Notch信號(hào)通路的影響本研究通過BrdU來檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞增殖,進(jìn)而探索Notch信號(hào)通路在其中發(fā)揮的作用。缺氧刺激12h后,BrdU陽性的細(xì)胞與總的細(xì)胞數(shù)的比值從31.7±3.8%增長(zhǎng)到了48.4±4.5%；而用DAPT處理過的細(xì)胞,BrdU陽性細(xì)胞的比率下降到了31±5%3. Notch信號(hào)通路對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的TNF-α和IL-1 β這些炎性因子的影響缺氧導(dǎo)致了星形膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α和IL-1 β的mRNA表達(dá)量的明顯提高,在用DAPT處理過的星形膠質(zhì)細(xì)胞中,TNF-α的mRNA的表達(dá)變化不大, IL-1 β的mRNA的表達(dá)受到了明顯的抑制。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,DAPT處理過的星形膠質(zhì)細(xì)胞中IL-1 β蛋白的表達(dá)量明顯減少,TNF-α蛋白的表達(dá)量沒有明顯變化。4. DAPT對(duì)缺氧的星形膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP和VEGF表達(dá)的影響抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞中的Notch信號(hào)通路導(dǎo)致GFAP的mRNA表達(dá)明顯降低。RT-PCR的結(jié)果顯示,在用DAPT處理過的星形膠質(zhì)細(xì)胞中,VEGF的mRNA的表達(dá)受到了明顯的抑制。ELISA的結(jié)果顯示,DAPT處理過的星形膠質(zhì)細(xì)胞中,VEGF的分泌減少。在缺氧的星形膠質(zhì)細(xì)胞中,VEGF的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組,但這種現(xiàn)象在經(jīng)過DAPT處理后消失。蛋白質(zhì)印記法結(jié)果顯示,低氧條件下的腦組織VEGF的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組,然而用DAPT處理后,低氧下,VEGF蛋白的表達(dá)量下降。5.低氧下NF-κB和VEGF通路對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和活化的影響蛋白印跡法和ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,低氧下星形膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB/p65表達(dá)明顯升高,經(jīng)DAPT處理后其表達(dá)下降。siRNA敲除VEGF和NF-κB后,抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞的增值和活化。研究結(jié)論1.在低氧環(huán)境下,原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中Notch被活化。2. Notch可以被DAPT阻滯,從而抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。3.在星形膠質(zhì)細(xì)胞中被阻滯了的Notch信號(hào)通路抑制了炎性因子IL-1 β的產(chǎn)生,對(duì)炎性因子TNF-α的影響不大。4.經(jīng)過DAPT處理過的缺氧的星形膠質(zhì)細(xì)胞抑制了GFAP和VEGF的表達(dá)。5.抑制NF-κB和VEGF通路能抑制缺氧的星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和活化。
【關(guān)鍵詞】：Notch 星形膠質(zhì)細(xì)胞 低氧 增殖 活化
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R364.4
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符號(hào)說明13-16
• 前言16-19
• 材料與方法19-34
• 結(jié)果34-37
• 討論37-38
• 結(jié)論38-39
• 附圖39-44
• 附表44-45
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 致謝49-50
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)位論文50-51
• 附件51

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本文編號(hào)：427044