本文關(guān)鍵詞：日本血吸蟲TOR基因克隆表達(dá)及生物學(xué)功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：血吸蟲病仍然是一個(gè)全球性公共衛(wèi)生問題,數(shù)以億計(jì)的人受其威脅。環(huán)境治理和藥物干預(yù)是當(dāng)前防控的主要措施。研發(fā)高效、安全的疫苗是血吸蟲病持續(xù)控制的研究方向之一。宿主補(bǔ)體是宿主免疫殺傷寄生蟲的重要效應(yīng)因子,血吸蟲可以通過一些自身蛋白調(diào)節(jié)宿主補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)而逃避宿主的免疫攻擊。血吸蟲體被表膜中具抑制補(bǔ)體功能的蛋白有可能成為疫苗候選分子。四跨膜孤兒受體(TOR)是一種多跨膜受體蛋白,具有補(bǔ)體C2結(jié)合位點(diǎn),可抑制C3轉(zhuǎn)化酶的形成而調(diào)節(jié)補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)。曼氏血吸蟲TOR(Sm TOR)的研究表明,該分子能誘導(dǎo)較高的保護(hù)效果。本文根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期日本血吸蟲體被表膜蛋白質(zhì)組研究結(jié)果,開展了日本血吸蟲TOR(Sj TOR)蛋白特性和生物學(xué)功能研究。根據(jù)Sj TOR參考序列,設(shè)計(jì)引物應(yīng)用PCR克隆得到Sj TOR基因片段,長度為1245 bps,編碼414個(gè)氨基酸,比對(duì)分析顯示與Sm TOR、埃及血吸蟲TOR(Sh TOR)、錐蟲TOR相似性分別為77.0%、72.0%、和75.0%。序列分析顯示,Sj TOR不含信號(hào)肽,具有5個(gè)N糖基化位點(diǎn);跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測表明,Sj TOR包含四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,Sj TOR在蟲體發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均有轉(zhuǎn)錄,在尾蚴時(shí)期轉(zhuǎn)錄水平最高,在雌蟲中的轉(zhuǎn)錄明顯高于雄蟲。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Sj TOR主要分布于蟲體的表膜,在實(shí)質(zhì)組織也有分布。根據(jù)Sj TOR第一個(gè)膜外區(qū)(Sj TOR-ed1,AA 47-168)序列設(shè)計(jì)合成引物,構(gòu)建含Sj TOR第一個(gè)膜外區(qū)(Sj TOR-ed1)基因的重組表達(dá)質(zhì)粒p ET-28a-Sj TOR-ed1,在BL21(DE3)大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá),并用組蛋白親和層析純化獲得重組蛋白r Sj TOR-ed1,分子量約為14 k Da。Western blot結(jié)果表明重組蛋白r Sj TOR-ed1具有良好的免疫原性。用重組蛋白r Sj TOR-ed1免疫小鼠,在兩次獨(dú)立的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中分別獲得了24.51%和26.51%的減蟲率及39.62%和32.92%的肝臟減卵率。ELISA結(jié)果表明重組蛋白r Sj TOR-ed1能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的特異性Ig G抗體,抗體亞型分析結(jié)果顯示,免疫重組蛋白r Sj TOR-ed1能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生Ig G1和Ig G2a抗體,且Ig G1與Ig G2a的比值在第4周達(dá)到最高后逐漸下降。溶血試驗(yàn)結(jié)果表明,重組蛋白r Sj TOR-ed1能抑制補(bǔ)體溶血且在濃度為0.2~1.0μM之間時(shí)其補(bǔ)體抑制作用呈劑量依賴性,蛋白濃度為10μM時(shí)的溶血抑制率可達(dá)60.26%。補(bǔ)體C2結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果表明,重組蛋白r Sj TOR-ed1可與補(bǔ)體C2結(jié)合。根據(jù)Sj TOR基因序列設(shè)計(jì)并合成4對(duì)特異的si RNAs,應(yīng)用浸泡法對(duì)體外培養(yǎng)的童蟲Sj TOR進(jìn)行干擾,實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,4對(duì)si RNAs對(duì)TOR基因的轉(zhuǎn)錄分別產(chǎn)生了45.12%、38.05%、25.46%、44.25%的干擾效果。綜上,本文成功克隆了Sj TOR基因,查明其在日本血吸蟲尾蚴中轉(zhuǎn)錄水平較高,主要表達(dá)分布在血吸蟲體被,并在大腸桿菌中表達(dá)純化到含其ed1的重組蛋白r Sj TOR-ed1,實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該重組蛋白r Sj TOR-ed1能通過與補(bǔ)體C2結(jié)合的方式抑制補(bǔ)體活性,用重組蛋白r Sj TOR-ed1免疫小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著的保護(hù)效果。研究結(jié)果表明Sj TOR是一種有潛力的抗血吸蟲疫苗候選分子。
【關(guān)鍵詞】：日本血吸蟲 四跨膜孤兒受體 C2結(jié)合蛋白 疫苗
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R383.24
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 英文縮略表12-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-23
• 1.1 引言13-14
• 1.2 血吸蟲免疫逃避14-17
• 1.2.1 血吸蟲免疫逃避方式14-17
• 1.2.2 小結(jié)與展望17
• 1.3 血吸蟲與補(bǔ)體17-20
• 1.3.1 補(bǔ)體激活途徑與補(bǔ)體調(diào)節(jié)18-20
• 1.4 血吸蟲病的疫苗研究20-23
• 第二章 日本血吸蟲基因SjTOR的克隆及其表達(dá)特性分析23-34
• 2.1 引言23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料23-25
• 2.2.1 生物材料23
• 2.2.2 主要儀器23-24
• 2.2.3 主要酶和試劑24
• 2.2.4 試劑配制24-25
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法25-28
• 2.3.1 SjTOR基因的克隆及生物信息學(xué)分析25-26
• 2.3.2 日本血吸蟲cDNA制備26-27
• 2.3.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析SjTOR在不同期別及性別蟲體中轉(zhuǎn)錄水平27-28
• 2.3.4 SjTOR在蟲體中的組織定位28
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-33
• 2.4.1 SjTOR基因的克隆及生物信息學(xué)分析28-31
• 2.4.2 實(shí)時(shí)定量PCR分析SjTOR在不同期別蟲體中的轉(zhuǎn)錄差異31-32
• 2.4.3 SjTOR蛋白的組織定位32-33
• 2.5 討論33-34
• 第三章 日本血吸蟲SjTOR-ed1的克隆表達(dá)及其免疫評(píng)估34-47
• 3.1 引言34
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料34-37
• 3.2.1 生物材料34
• 3.2.2 主要儀器34-35
• 3.2.3 主要酶和試劑35
• 3.2.4 試劑配制35-37
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法37-41
• 3.3.1 SjTOR-ed1片段的克隆、表達(dá)及純化37-39
• 3.3.2 Western Blot檢測重組蛋白的免疫原性39
• 3.3.3 重組蛋白rSjTOR-ed1動(dòng)物免疫保護(hù)效果評(píng)估39-40
• 3.3.4 ELISA檢測特異性抗體水平40-41
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-45
• 3.4.1 SjTOR-ed1片段的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒pET-28a-SjTOR-ed1的構(gòu)建41
• 3.4.2 重組蛋白rSjTOR-ed1的表達(dá)及純化41-42
• 3.4.3 重組蛋白rSjTOR-ed1的免疫原性分析42-43
• 3.4.4 重組蛋白rSjTOR-ed1誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效果評(píng)估43-44
• 3.4.5 抗rSjTOR-ed1特異性抗體水平的檢測44-45
• 3.5 討論45-47
• 第四章 SjTOR-ed1的功能研究及RNA干擾分子的篩選47-55
• 4.1 引言47
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料47-49
• 4.2.1 主要儀器47
• 4.2.2 生物材料及主要試劑47-48
• 4.2.3 試劑配制48-49
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法49-51
• 4.3.1 綿羊紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)49-50
• 4.3.2 重組蛋白rSjTOR-ed1與補(bǔ)體C2的結(jié)合試驗(yàn)50
• 4.3.3 日本血吸蟲TOR特異RNA干擾分子的篩選50-51
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-53
• 4.4.1 重組蛋白rSjTOR-ed1可以抑制補(bǔ)體溶血并可結(jié)合補(bǔ)體C251-52
• 4.4.2 日本血吸蟲TOR基因特異RNA干擾分子的篩選52-53
• 4.5 討論53-55
• 第五章 全文總結(jié)55-56
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 致謝61-62
• 作者簡歷62

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 卞國武,余新炳,吳忠道,徐勁,周俊梅,單志新,馬長玲,邵筱;日本血吸蟲(中國大陸株)Sj16基因的原核表達(dá)[J];中國血吸蟲病防治雜志;2001年06期

2 姜寧;尹繼剛;胡哲;張嘉保;陳啟軍;;血吸蟲基因組及疫苗的研究進(jìn)展[J];中國基礎(chǔ)科學(xué);2007年04期

3 李石柱;鄭浩;高婧;張利娟;朱蓉;許靜;郭家鋼;肖寧;周曉農(nóng);;2012年全國血吸蟲病疫情通報(bào)[J];中國血吸蟲病防治雜志;2013年06期

  本文關(guān)鍵詞：日本血吸蟲TOR基因克隆表達(dá)及生物學(xué)功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：426345