本文關(guān)鍵詞：利用酪蛋白激酶Ⅰδ磷酸化修飾半乳糖凝集素-3，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：半乳糖凝集素-3(Galectin-3)是半乳糖凝集素家族中唯一的嵌合型蛋白,其分子量約為31 kDa。作為一種腫瘤相關(guān)蛋白,Galectin-3在腫瘤細(xì)胞中高表達,與細(xì)胞生長、粘附、凋亡以及血管生成、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。酪蛋白激酶I(Casein Kinase I)是絲氨酸/蘇氨酸選擇性蛋白激酶,共有7個亞型(α,β,γ1,γ2,γ3,ε,δ),分子量為22到55 kDa,等電點大于9。多分布于真核細(xì)胞中的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和紡錘體中。Casein Kinase I有重要的生理功能,它參與很多生理生化過程,如生命節(jié)律、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA修復(fù)和DNA翻譯等。文獻報道,Galectin-3能被Casein Kinase Iδ磷酸化,細(xì)胞內(nèi)30%Galectin-3以磷酸化的形式存在,但磷酸化的Galectin-3的功能卻不清楚。為此,本論文作為研究磷酸化Galectin-3功能的前期工作,探索了Casein Kinase Iδ磷酸化Galectin-3的生化反應(yīng)條件,檢測方法以及磷酸化位點,為大量制備磷酸化的Galectin-3和深入研究其功能奠定基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容和成果如下:首先,構(gòu)建Casein Kinase Iδ表達載體,并表達純化Casein Kinase Iδ蛋白。主要過程包括:從人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116中提取細(xì)胞總RNA,經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)NCBI Gene Bank收錄的Casein Kinase Iδ序列設(shè)計引物,以cDNA為模板,擴增出Casein Kinase Iδ的目的基因序列。經(jīng)過測序結(jié)果比對,確認(rèn)目的基因序列正確。對目的基因與載體進行酶切、連接、轉(zhuǎn)化,構(gòu)建了pET 28a Casein Kinase Iδ表達質(zhì)粒。用Ni-NTA親和柱提取和純化目的蛋白。經(jīng)過SDS-PAGE檢測,獲得的目的蛋白為Casein Kinase Iδ蛋白。然后,建立兩種檢測Casein Kinase Iδ催化Galectin-3磷酸化的方法。通過HPLC對Galectin-3磷酸化反應(yīng)體系中ATP消耗情況進行檢測,我們發(fā)現(xiàn)Casein Kinase Iδ能夠?qū)alectin-3磷酸化,反應(yīng)消耗了ATP;通過Native-PAGE與Western blot對Galectin-3磷酸化反應(yīng)產(chǎn)物進行檢測,我們發(fā)現(xiàn)在磷酸化反應(yīng)后有被Galectin-3特異性抗體所識別的磷酸化條帶產(chǎn)生�；谝陨蠈嶒灲Y(jié)果,我們認(rèn)為這兩種檢測方法都可以用來檢測由Casein Kinase Iδ催化的Galectin-3磷酸化反應(yīng)。此外,我們對磷酸化反應(yīng)條件進行了優(yōu)化。當(dāng)固定底物Galectin-3的量為25μg,ATP為200μM時,優(yōu)化得到了反應(yīng)條件,即Casein Kinase Iδ的量為0.375μg,反應(yīng)溫度為20 oC,反應(yīng)時間為10 min。最后,對Galectin-3的磷酸化位點進行探究�？紤]到Casein Kinase Iδ為絲氨酸選擇性蛋白激酶,我們設(shè)計引物將Galectin-3的絲氨酸(6位、12位、96位和188位)定點突變?yōu)楸彼帷＝?jīng)電泳驗證、測序比對,我們得到了僅有目標(biāo)位點發(fā)生突變的4種突變體質(zhì)粒。之后,我們誘導(dǎo)突變體蛋白表達,并用Lactose-Sepharose CL 6B凝膠柱對突變體蛋白進行分離純化。通過對比突變型與野生型Galectin-3的磷酸化反應(yīng)情況,我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)6位的絲氨酸發(fā)生突變時,磷酸化條帶消失,磷酸化反應(yīng)不能發(fā)生。據(jù)此我們得出結(jié)論:由Casein Kinase Iδ催化的Galectin-3磷酸化發(fā)生在Galectin-3的N端6位絲氨酸。
【關(guān)鍵詞】：半乳糖凝集素-3 酪蛋白激酶Iδ 磷酸化修飾
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R3411;Q51
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 中英文對照及英文縮寫詞表7-10
• 第一章 前言10-18
• 1.1 Galectin-3 的概述10-14
• 1.2 Casein Kinase I的概述14-16
• 1.3 Galectin-3 磷酸化修飾的研究進展16-17
• 1.4 選題依據(jù)及研究意義17-18
• 第二章 Casein Kinase Iδ 表達載體構(gòu)建和蛋白提取18-30
• 2.1 實驗材料、試劑與儀器18-21
• 2.1.1 實驗材料與試劑18-19
• 2.1.2 實驗試劑配制19-21
• 2.1.3 實驗儀器21
• 2.2 實驗方法21-25
• 2.2.1 引物設(shè)計21
• 2.2.2 RT-PCR擴增目的基因21-22
• 2.2.3 目的基因與質(zhì)粒的雙酶切反應(yīng)22-23
• 2.2.4 目的基因與質(zhì)粒的連接23
• 2.2.5 制備感受態(tài)細(xì)菌23
• 2.2.6 目的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化23-24
• 2.2.7 Colony PCR驗證24
• 2.2.8 提取質(zhì)粒并測序24
• 2.2.9 誘導(dǎo)菌體表達目的蛋白24
• 2.2.10 目的蛋白提取與純化24-25
• 2.2.11 變性聚丙烯胺凝膠電泳25
• 2.2.12 蛋白透析與保存25
• 2.3 實驗結(jié)果與討論25-30
• 2.3.1 目的片段的獲得25
• 2.3.2 構(gòu)建表達質(zhì)粒25-26
• 2.3.3 測序結(jié)果26-28
• 2.3.4 目的蛋白的誘導(dǎo)表達28-30
• 第三章 Casein Kinase Iδ 催化Galectin-3 磷酸化的反應(yīng)體系和檢測方法的研究30-38
• 3.1 實驗材料、試劑與儀器30-31
• 3.1.1 實驗材料與試劑30
• 3.1.2 實驗試劑配制30-31
• 3.1.3 實驗儀器31
• 3.2 實驗方法31-33
• 3.2.1 Galectin-3 的磷酸化反應(yīng)31-32
• 3.2.2 HPLC法檢測Galectin-3 磷酸化反應(yīng)中ATP的消耗情況32
• 3.2.3 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳32
• 3.2.4 考馬斯亮藍(lán)染色與脫色32
• 3.2.5 蛋白免疫印跡32
• 3.2.6 優(yōu)化Galectin-3 磷酸化反應(yīng)條件32-33
• 3.3 實驗結(jié)果與討論33-38
• 3.3.1 HPLC檢測Galectin-3 磷酸化反應(yīng)中ATP消耗情況33-35
• 3.3.2 電泳和免疫印跡法檢測Galectin-3 磷酸化反應(yīng)產(chǎn)物35-36
• 3.3.3 Galectin-3 磷酸化反應(yīng)條件優(yōu)化36-38
• 第四章 Galectin-3 磷酸化位點的確定38-52
• 4.1 實驗材料、試劑與儀器38-39
• 4.1.1 實驗材料與試劑38
• 4.1.2 實驗儀器38-39
• 4.2 實驗方法39-41
• 4.2.1 定點突變實驗39-40
• 4.2.2 突變體蛋白的提取40-41
• 4.3 實驗結(jié)果與討論41-52
• 4.3.1 定點突變實驗41-50
• 4.3.2 Galectin-3 突變體蛋白的提取50
• 4.3.3 Galectin-3 磷酸化位點的確定50-52
• 總結(jié)52-54
• 參考文獻54-58
• 致謝58

【參考文獻】

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1 繆宇,王承龍,殷惠軍,史大卓,陳可冀;高效液相色譜測定大鼠心肌組織腺苷酸含量[J];北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2005年02期

2 劉煒;畢玉平;李臻;;Ⅰ型酪蛋白激酶的研究進展[J];西北植物學(xué)報;2008年02期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 高曉鴿;人參果膠與半乳凝素-3相互作用的構(gòu)效關(guān)系研究[D];東北師范大學(xué);2014年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 薛慧婷;果膠與半乳凝素-3的相互作用對T細(xì)胞聚集及凋亡的影響[D];東北師范大學(xué);2012年

  本文關(guān)鍵詞：利用酪蛋白激酶Ⅰδ磷酸化修飾半乳糖凝集素-3，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：425055