禽流感病毒NS1蛋白在流感病毒感染宿主細(xì)胞后大量表達(dá),但在成熟病毒粒子中并不存在,因此被稱為非結(jié)構(gòu)蛋白。NS1在流感病毒感染宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮著十分重要的作用,主要包括抵抗宿主的免疫應(yīng)答,阻止干擾素生成,進(jìn)一步拮抗干擾素形成的病毒防線等。此外NS1還是禽流感病毒中重要的毒力因子,其關(guān)鍵位點(diǎn)能夠影響流感病毒的致病性。NS1還能夠調(diào)節(jié)mRNA的剪切和核-質(zhì)輸出,這些對病毒感染和復(fù)制大有幫助。NS1蛋白是禽流感病毒中關(guān)鍵的致病因子,能夠與多種蛋白發(fā)生相互作用,改變宿主蛋白的胞內(nèi)分布,進(jìn)一步調(diào)節(jié)病毒的毒力和致病性。為了進(jìn)一步研究NS1蛋白在禽流感病毒復(fù)制以及致病過程中的作用,本研究以H5N1型禽流感病毒的NS1蛋白為誘餌,構(gòu)建了帶有GST標(biāo)簽的重組質(zhì)粒,初步優(yōu)化表達(dá)條件,經(jīng)純化得到較高純度的融合蛋白。通過GST-Pull down技術(shù),以GST蛋白為對照,在人肺腺癌A549細(xì)胞系中篩選出更多與NS1相互作用的蛋白。為了驗(yàn)證潛在的互作蛋白與NS1之間的相互作用,原核表達(dá)兩種蛋白,利用ELISA技術(shù)驗(yàn)證兩蛋白間的互作;真核表達(dá)兩種蛋白,利用Co-IP技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證兩蛋白的互作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:與GS...

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 緒論
    1.1 禽流感病毒NS1 蛋白研究進(jìn)展
        1.1.1 禽流感病毒簡介
        1.1.2 非結(jié)構(gòu)蛋白NS1 簡介
        1.1.3 NS1 蛋白與細(xì)胞凋亡
        1.1.4 NS1 互作宿主蛋白
    1.2 α-actinin4 蛋白簡介
        1.2.1 α-actinin4 的分子特征以及組織分布
        1.2.2 α-actinin4 蛋白的生物學(xué)功能
        1.2.3 α-actinin4 在禽流感疾病中的作用
    1.3 常用蛋白質(zhì)互作研究方法
        1.3.1 酵母雙雜交
        1.3.2 雙分子熒光互補(bǔ)分析技術(shù)
        1.3.3 Pull down
        1.3.4 免疫共沉淀
    1.4 研究目的與意義
    1.5 研究技術(shù)路線
第2章 NS1 互作蛋白的篩選
    2.1 材料與方法
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料
        2.1.2 構(gòu)建GST標(biāo)簽表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)方法
        2.1.3 融合蛋白的表達(dá)及親和純化實(shí)驗(yàn)方法
        2.1.4 A549 細(xì)胞的培養(yǎng)及裂解實(shí)驗(yàn)方法
        2.1.5 Pull Down互作蛋白及質(zhì)譜鑒定實(shí)驗(yàn)方法
    2.2 結(jié)果分析
        2.2.1 構(gòu)建GST標(biāo)簽載體結(jié)果分析
        2.2.2 融合蛋白表達(dá)及親和純化結(jié)果分析
        2.2.3 Pull down互作蛋白結(jié)果分析
    2.3 討論
    2.4 本章小結(jié)
第3章 NS1 蛋白互作的驗(yàn)證
    3.1 材料與方法
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料
        3.1.2 ELISA驗(yàn)證蛋白互作實(shí)驗(yàn)方法
        3.1.3 Co-IP驗(yàn)證蛋白互作實(shí)驗(yàn)方法
    3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
        3.2.1 ELISA驗(yàn)證蛋白互作結(jié)果分析
        3.2.2 Co-IP驗(yàn)證蛋白互作結(jié)果分析
    3.3 討論
    3.4 本章小結(jié)
第4章 總結(jié)與展望
    4.1 總結(jié)
    4.2 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄 1 主要儀器設(shè)備表
附錄 2 主要試劑表
附錄 3
附錄 4
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文情況



本文編號：4038053