目的采用E. coli表達系統(tǒng)分別表達心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)和cTnC,制備cTnI-cTnC二元復(fù)合蛋白,并驗證其抗原性能。方法將合成的cTnI和cTnC基因片段分別插入pET-22b和pET-28a原核表達載體,構(gòu)建重組表達質(zhì)粒,并分別轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達。將表達的cTnI和cTnC蛋白經(jīng)Ni²⁺螯合親和層析和離子交換層析兩步純化后,在Ca²⁺存在的條件下按摩爾比1︰1混合,制備cTnI-cTnC二元復(fù)合蛋白。采用雙抗夾心ELISA法檢測復(fù)合蛋白的抗原反應(yīng)性;將cTnI單體和cTnI-cTnC復(fù)合蛋白稀釋后,均分別于4和37℃條件下放置14 d,檢測cTnI抗原放置前后的濃度變化,驗證其儲存穩(wěn)定性。結(jié)果純化的cTnI和cTnC重組蛋白的SDSPAGE純度均達90%以上。與對照抗原(8IC63二元復(fù)合抗原)比較,cTnI-cTnC復(fù)合蛋白與抗體反應(yīng)信號較強,且能夠同時被cTnI和cTnC抗體識別;經(jīng)37℃熱加速試驗后,cTnI單體蛋白濃度降低約80%,而cTnI-...

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【部分圖文】：

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，cTnI-pET-22b質(zhì)粒的菌落PCR和雙酶切產(chǎn)物可見約600bp的特異片段，cTnC-pET-28a質(zhì)粒的菌落PCR和雙酶切產(chǎn)物可見498bp的特異片段，大小均與cTnI和cTnC基因片段理論值相符，見圖1和圖2。測得序列與原始模板基因序列比對完全....

與對照抗原比較，cTnI-cTnC復(fù)合蛋白與抗體反應(yīng)信號較強，表明其具有良好的抗原反應(yīng)性；且cTnI-cTnC復(fù)合蛋白能夠同時被cTnI和cTnC抗體識別，表明cTnI-cTnC結(jié)合形成的復(fù)合物狀態(tài)單一穩(wěn)定。見表1。圖3純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

圖2重組表達質(zhì)粒cTnC-pET-28a的PCR及雙酶切鑒定（NcoⅠ/BamHⅠ）2.3.2儲存穩(wěn)定性

在4和37℃儲存條件下放置14d,cTnI單體蛋白濃度較起始濃度均較大幅度降低，降幅達30%～80%之間，可能的原因是在儲存過程中發(fā)生蛋白降解導(dǎo)致其濃度大幅降低，且37℃加速了其降解速率；而cTnI-cTnC復(fù)合蛋白的濃度變化較小，即使在37℃熱加速條件下，濃度變化幅度均在±1....

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