目的 分析缺氧誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生外泌體，并對外泌體的形態(tài)特征進(jìn)行分析鑒定。方法 首先采用佛波酯誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞促使其分化成為巨噬細(xì)胞，分別收集缺氧干預(yù)0,12,24 h的巨噬細(xì)胞源性外泌體，通過BCA方法提取外泌體蛋白，使用Western blot方法測定分析外泌體陰性對照蛋白Histone和外泌體表面標(biāo)志蛋白CD63和HSP70的表達(dá)。利用透射電子顯微鏡及Nanosight NS300儀分析外泌體的形態(tài)、特征及粒徑大小。結(jié)果 與缺氧干預(yù)0 h及12 h相比，缺氧干預(yù)24 h所得的巨噬細(xì)胞源性外泌體蛋白含量、CD63及HSP70的表達(dá)升高(P<0.05),而三組外泌體中均未檢出Histone蛋白。外泌體呈形態(tài)均一的類圓形，表面有完整的雙層模型結(jié)構(gòu)，大多數(shù)外泌體顆粒的粒徑集中在154 nm左右。結(jié)論 成功從缺氧干預(yù)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離提取出外泌體，通過檢測其特異性標(biāo)志蛋白及形態(tài)學(xué)分析顯示提取的外泌體含量及純度較高。

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圖1PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞(×100)

以不同蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，將各濃度蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在568nm處的吸光度值作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測外泌體的濃度(見圖2)。結(jié)果顯示，缺氧0,12,24h干預(yù)條件下，所得的20ml細(xì)胞上清培養(yǎng)液分別提取的外泌體蛋白濃度約為(3.22±0.22)mg/ml....

圖2BCA標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測外泌體蛋白濃度

圖1PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞(×100)2.3缺氧誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞外泌體的標(biāo)記蛋白表達(dá)

圖3外泌體中HSP70、CD63、Histone蛋白水平隨時間的變化

CD63、HSP70在各種細(xì)胞的外泌體中均有表達(dá)，是外泌體特征性的標(biāo)記蛋白，而Histone作為外泌體的陰性對照蛋白。本研究經(jīng)Westernblot分析顯示，缺氧干預(yù)巨噬細(xì)胞分泌的外泌體中存在HSP70、CD63蛋白表達(dá)(見圖3),而Histone蛋白無表達(dá)。缺氧0h與缺氧1....

圖4外泌體的形態(tài)特征

透射電子顯微鏡結(jié)果顯示，缺氧誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌的外泌體呈形態(tài)均一的類圓形，表面有完整的雙層模型結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部含有低密度物質(zhì)，多呈單個散狀分布(見圖4A)。采用NTA檢測系統(tǒng)進(jìn)一步分析外泌體顆粒的粒徑大小，結(jié)果顯示，外泌體的粒徑集中在(150±44)nm,大多數(shù)外泌體顆粒的粒徑集中在....

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