目的:構(gòu)建人短鏈胸腺基質(zhì)淋巴生成素(short isoform thymic stromal lymphopoietin,sfTSLP)啟動(dòng)子全長及其長度不等片段的螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒,以確定啟動(dòng)子活性區(qū)域并預(yù)測功能性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。方法:使用按基因組序列設(shè)計(jì)的引物,通過PCR分離人sf TSLP啟動(dòng)子片段,并將之插入螢光素酶報(bào)告基因載體pGL3-basic中。通過步移缺失構(gòu)建其截短片段,通過雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)測定所有啟動(dòng)子缺失克隆在HEK-293細(xì)胞中的活性,并使用生物信息學(xué)手段預(yù)測其潛在的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果:經(jīng)菌液PCR、雙酶切、測序,成功構(gòu)建了人sfTSLP啟動(dòng)子及其截短片段螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒,并確定其啟動(dòng)子活性區(qū)域位于5′側(cè)翼區(qū)-200～+25 nt區(qū)域內(nèi),且可能含有SP1/SP3、SPI1/SPIB、TCF3、ETS1等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)論:首次對人sfTSLP啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行了研究,初步確定了其啟動(dòng)子活性區(qū)域及可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),為更進(jìn)一步的研究指明了方向。

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【部分圖文】：

圖2人sfTSLP啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

圖1pTSLP-1質(zhì)粒構(gòu)建與驗(yàn)證2.2近端啟動(dòng)子區(qū)缺失質(zhì)粒的構(gòu)建

圖3人sfTSLP啟動(dòng)子熒光素報(bào)告基因重組質(zhì)粒在HEK-293細(xì)胞中相對螢光素酶活性

根據(jù)上述人TSLP啟動(dòng)子重組質(zhì)粒的螢光素酶活性檢測結(jié)果分析，提示-200～+25nt區(qū)域內(nèi)可能存在明顯影響啟動(dòng)子活性的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，應(yīng)用JARSPAR對該區(qū)域進(jìn)行分析，獲得可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。如圖4所示，預(yù)測結(jié)果提示該序列范圍內(nèi)可能存在SPI1、SPIB、SP1/SP3....

圖4運(yùn)用JASPAR網(wǎng)站預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)

圖3人sfTSLP啟動(dòng)子熒光素報(bào)告基因重組質(zhì)粒在HEK-293細(xì)胞中相對螢光素酶活性3討論

圖1pTSLP-1質(zhì)粒構(gòu)建與驗(yàn)證

選取6個(gè)生長良好的單克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，所提質(zhì)粒經(jīng)MIUⅠ及XhoⅠ雙酶切后電泳，可見2條特異性片段，1條約5000bp即pGL3-basic載體片段，另1條片段大小約為2000bp，與目的片段大小相同（圖1B）。核酸序列測定結(jié)果提示，此片段核苷酸序列....

本文編號：4004950