發(fā)布時(shí)間：2017-05-25 08:03

  本文關(guān)鍵詞：小腸結(jié)腸炎耶爾森菌非特異性核酸酶的結(jié)構(gòu)分析及定點(diǎn)突變研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica subsp.palearctica(Y.e.p))核酸酶是一種非特異性核酸酶,可以降解各種DNA和RNA,無論是單鏈、雙鏈、線狀、環(huán)狀還是超螺旋形式,而且對(duì)核酸的序列沒有要求。本實(shí)驗(yàn)室前期成功克隆了Y.e.p核酸酶的編碼基因nuc,構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET24a-nuc,利用IPTG誘導(dǎo)獲得重組核酸酶,研究了其酶學(xué)性質(zhì),發(fā)現(xiàn)重組核酸酶不僅具有酶活性高的優(yōu)點(diǎn),而且還具有超級(jí)耐高溫、耐酸堿及耐化學(xué)物質(zhì)等特點(diǎn)。為闡明該酶具有優(yōu)良性能的原因,本論文通過生物信息學(xué)分析和定點(diǎn)突變的方法研究影響Y.e.p非特異性核酸酶酶活和熱穩(wěn)定性的因素,為進(jìn)一步研究Y.e.p非特異性核酸酶的功能進(jìn)化奠定基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:(1)用生物學(xué)軟件全面分析Y.e.p非特異性核酸酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域和三級(jí)結(jié)構(gòu),為Y.e.p非特異性核酸酶的定點(diǎn)突變研究提供理論基礎(chǔ)。(2)通過對(duì)Y.e.p非特異性核酸酶活性位點(diǎn)、鹽橋和二硫鍵定點(diǎn)突變的研究,改變活性位點(diǎn)氨基酸、破壞鹽橋和二硫鍵組成,發(fā)現(xiàn)Y.e.p非特異性核酸酶酶活和熱穩(wěn)定性急劇下降,說明活性位點(diǎn)對(duì)維持Y.e.p非特異性核酸酶的酶活,鹽橋和二硫鍵對(duì)維持Y.e.p非特異性核酸酶的熱穩(wěn)定性具有重要作用。(3)序列比對(duì)熱不穩(wěn)定Y.e.e非特異性核酸酶和熱穩(wěn)定Y.e.p非特異性核酸酶,對(duì)差異氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變,結(jié)果發(fā)現(xiàn)E202A,I203F,D264E這三個(gè)位點(diǎn)氨基酸的改變能引起酶活及熱穩(wěn)定性變化,由此推測(cè)Glu202,Ile203和Asp264可能是影響Y.e.p非特異性核酸酶酶活和熱穩(wěn)定性的關(guān)鍵氨基酸殘基。
【關(guān)鍵詞】：小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 非特異性核酸酶 定點(diǎn)突變 酶活 熱穩(wěn)定性
【學(xué)位授予單位】：杭州師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q78;R378
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 第一章 緒論12-20
• 1.1 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌簡(jiǎn)介12
• 1.2 非特異性核酸酶概述12-15
• 1.2.1 概念及發(fā)現(xiàn)12-13
• 1.2.2 催化作用方式13
• 1.2.3 熱穩(wěn)定性13-15
• 1.2.4 生物功能15
• 1.3 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌非特異性核酸酶研究15-16
• 1.4 酶分子的定點(diǎn)突變技術(shù)研究進(jìn)展16-18
• 1.4.1 定點(diǎn)突變?cè)?/span>16-17
• 1.4.2 酶分子的結(jié)構(gòu)分析和定點(diǎn)突變應(yīng)用進(jìn)展17-18
• 1.5 立題意義和主要研究?jī)?nèi)容18-20
• 1.5.1 立題意義18
• 1.5.2 主要研究?jī)?nèi)容18-19
• 1.5.3 技術(shù)路線19-20
• 第二章 Y.e.p非特異性核酸酶的生物信息學(xué)分析20-26
• 2.1 材料與方法20
• 2.2 結(jié)果與討論20-25
• 2.2.1 Y.e.p非特異性核酸酶一級(jí)結(jié)構(gòu)分析20-22
• 2.2.2 Y.e.p非特異性核酸酶二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和結(jié)構(gòu)域分析22-24
• 2.2.3 Y.e.p非特異性核酸酶三級(jí)結(jié)構(gòu)分析24-25
• 2.3 本章小結(jié)25-26
• 第三章 活性位點(diǎn)對(duì)Y.e.p非特異性核酸酶酶活的影響26-34
• 3.1 材料26-28
• 3.1.1 菌株與質(zhì)粒26
• 3.1.2 工具酶和試劑盒26
• 3.1.3 主要試劑26-27
• 3.1.4 培養(yǎng)基和工作液27
• 3.1.5 主要儀器27-28
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法28-31
• 3.2.1 定點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)28
• 3.2.2 定點(diǎn)突變基因的獲得28-29
• 3.2.3 突變酶的誘導(dǎo)表達(dá)29
• 3.2.4 突變酶蛋白含量測(cè)定29-30
• 3.2.5 酶活測(cè)定30-31
• 3.3 結(jié)果與討論31-33
• 3.3.1 活性位點(diǎn)預(yù)測(cè)31
• 3.3.2 突變位點(diǎn)選擇31
• 3.3.3 蛋白含量測(cè)定31
• 3.3.4 酶活測(cè)定和分析31-33
• 3.4 本章小結(jié)33-34
• 第四章 鹽橋?qū).e.p非特異性核酸酶熱穩(wěn)定性的影響34-38
• 4.1 材料34
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法34-35
• 4.2.1 定點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)34
• 4.2.2 定點(diǎn)突變基因的獲得34
• 4.2.3 突變酶的誘導(dǎo)表達(dá)34
• 4.2.4 突變酶蛋白含量測(cè)定34
• 4.2.5 熱穩(wěn)定性測(cè)定34-35
• 4.3 結(jié)果與討論35-37
• 4.3.1 鹽橋分析35
• 4.3.2 突變位點(diǎn)選擇35
• 4.3.3 蛋白含量測(cè)定35-36
• 4.3.4 熱穩(wěn)定性測(cè)定和分析36-37
• 4.4 本章小結(jié)37-38
• 第五章 二硫鍵對(duì)Y.e.p非特異性核酸酶熱穩(wěn)定性的影響38-47
• 5.1 材料38
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法38-42
• 5.2.1 二硫鍵質(zhì)譜分析38-39
• 5.2.1.1 質(zhì)譜分析原理38
• 5.2.1.2 質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)方法38-39
• 5.2.1.3 質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理39
• 5.2.2 定點(diǎn)突變39-42
• 5.2.2.1 定點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)39-40
• 5.2.2.2 定點(diǎn)突變基因的獲得40-42
• 5.2.2.3 突變酶的誘導(dǎo)表達(dá)42
• 5.2.2.4 突變酶蛋白含量測(cè)定42
• 5.2.2.5 熱穩(wěn)定性測(cè)定42
• 5.3 結(jié)果與討論42-46
• 5.3.1 二硫鍵預(yù)測(cè)42-43
• 5.3.2 二硫鍵的質(zhì)譜分析43-44
• 5.3.3 突變位點(diǎn)選擇44-45
• 5.3.4 蛋白含量測(cè)定45
• 5.3.5 熱穩(wěn)定性測(cè)定和分析45-46
• 5.4 本章小結(jié)46-47
• 第六章 基于熱不穩(wěn)定和熱穩(wěn)定核酸酶序列比對(duì)的定點(diǎn)突變研究47-52
• 6.1 材料47
• 6.2 實(shí)驗(yàn)方法47-48
• 6.2.1 定點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)47-48
• 6.2.2 定點(diǎn)突變基因的獲得48
• 6.2.3 突變酶的誘導(dǎo)表達(dá)48
• 6.2.4 突變酶蛋白含量測(cè)定48
• 6.2.5 酶活測(cè)定48
• 6.2.6 熱穩(wěn)定性測(cè)定48
• 6.3 結(jié)果與討論48-51
• 6.3.1 突變位點(diǎn)選擇48-49
• 6.3.2 蛋白含量測(cè)定49-50
• 6.3.3 酶活測(cè)定和分析50
• 6.3.4 熱穩(wěn)定性測(cè)定和分析50-51
• 6.4 本章小結(jié)51-52
• 結(jié)論與展望52-54
• 參考文獻(xiàn)54-60
• 英文縮略詞60-61
• 作者簡(jiǎn)介61-62

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 鄭敏婧;李曉云;李玲;;野葛葡糖基轉(zhuǎn)移酶PlUGTs的同源建模及其活性位點(diǎn)分析[J];生物信息學(xué);2013年04期

  本文關(guān)鍵詞：小腸結(jié)腸炎耶爾森菌非特異性核酸酶的結(jié)構(gòu)分析及定點(diǎn)突變研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：393100