本文關(guān)鍵詞：吡喹酮（PZQ）衍生物對日本血吸蟲PZQ抗性蟲體的生物學(xué)效應(yīng)及PZQ抗性蟲體蛋白質(zhì)組學(xué)分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:前期研究證明PZQ衍生物P96及DW-3-15具有顯著的抗日本血吸蟲成蟲及童蟲效應(yīng),本實(shí)驗(yàn)體外觀察P96及DW-3-15對日本血吸蟲PZQ抗性蟲體的生物學(xué)效應(yīng),探討P96及DW-3-15作為抗日本血吸蟲候選新藥的潛在價(jià)值。方法:單性日本血吸蟲尾蚴(70±5條)感染小鼠,21天后,用半數(shù)有效致死劑量(ED50,25.98 mg/kg)PZQ對小鼠進(jìn)行灌胃給藥,每天一次,連續(xù)30天,停藥21天后,再給予小鼠治療劑量(200 mg/kg)PZQ,連續(xù)5天。停藥2周后肝門靜脈灌注收集蟲體,置DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng),分別加入不同濃度PZQ、P96和DW-3-15,作用16 h(過夜)后換新鮮培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)72 h,每24 h體視顯微鏡下觀察、記錄一次蟲體活力和形態(tài)變化,評價(jià)誘導(dǎo)蟲體對藥物的敏感性。結(jié)果:PZQ、P96和DW-3-15體外抗未誘導(dǎo)日本血吸蟲成蟲的臨界致死濃度(蟲體經(jīng)藥物作用后72 h活力降低率達(dá)90%的最低濃度)分別為14μmol/L、25μmol/L和45μmol/L。誘導(dǎo)蟲體對PZQ的敏感性顯著降低,臨界致死濃度是抗未誘導(dǎo)蟲體的8倍(112μmol/L);而對P96的敏感性有一定的下降,臨界致死濃度是抗未誘導(dǎo)蟲體的4倍(100μmol/L);對DW-3-15的敏感性與未誘導(dǎo)蟲體相比則沒有明顯差異,臨界致死濃度仍為45μmol/L。結(jié)論:經(jīng)PZQ持續(xù)壓力誘導(dǎo)的日本血吸蟲對PZQ具有明顯抗性,與P96及DW-3-15相比存在顯著性差異(P0.05),特別是對DW-3-15完全沒有交叉抗性;提示PZQ衍生物P96及DW-3-15抗日本血吸蟲的作用靶點(diǎn)與PZQ可能有一定差異,其作用機(jī)制可能不同,具有作為抗日本血吸蟲候選新藥的潛在價(jià)值,值得進(jìn)一步研究。目的:通過觀察Ahnak抗體拮抗PZQ體外抗日本血吸蟲成蟲生物學(xué)效應(yīng),探討Ahnak蛋白是否是PZQ作用的重要靶分子。方法:肝門靜脈灌注法收集感染小鼠體內(nèi)的日本血吸蟲成蟲,進(jìn)行體外培養(yǎng),加入不同濃度(0.3、0.6、1.2、1.8、2.4μg/ml)Ahnak抗體,預(yù)孵育不同時(shí)間(0、1、2、4 h)后,再加入PZQ,作用16 h(過夜)后換液,繼續(xù)培養(yǎng)72h,每隔24h置體視顯微鏡下觀察、記錄一次蟲體存活數(shù)量和活力分值。結(jié)果:Ahnak抗體預(yù)孵育1 h,濃度為1.2μg/ml和1.8μg/ml時(shí),對PZQ有明顯拮抗作用,蟲體72 h存活率均高達(dá)80%,活力降低率分別為71.1%和64.4%,與PZQ對照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其它濃度(0.3、0.6、2.4μg/ml)抗體對PZQ均無拮抗作用;抗體濃度為1.2μg/ml,預(yù)孵育時(shí)間為1 h,對PZQ有明顯拮抗作用,其它預(yù)孵育時(shí)間(0、2、4 h),抗體對PZQ均無明顯拮抗作用。結(jié)論:Ahnak抗體對PZQ的體外抗日本血吸蟲成蟲效應(yīng)有一定的拮抗作用,Ahnak抗體預(yù)孵育1 h,濃度為1.2μg/ml是對PZQ的最佳拮抗方案,本研究結(jié)果為“鈣通道—PZQ抗血吸蟲效應(yīng)靶點(diǎn)”假說提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù),Ahnak蛋白在日本血吸蟲中的作用值得進(jìn)一步研究。目的:利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法和技術(shù)分離、鑒定PZQ抗性蟲體與未誘導(dǎo)蟲體之間的差異蛋白質(zhì),探討PZQ抗血吸蟲效應(yīng)機(jī)制及潛在靶點(diǎn)。方法:應(yīng)用PZQ抗日本血吸蟲ED50和治療劑量,使感染小鼠體內(nèi)的蟲體在持續(xù)藥物壓力下產(chǎn)生一定的抗藥性,收集抗性蟲體和未誘導(dǎo)蟲體,提取總蛋白,采用雙向凝膠電泳(2D-PAGE)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)技術(shù)篩選、鑒定兩種蟲體的差異表達(dá)蛋白質(zhì)。結(jié)果:經(jīng)篩選、鑒定,PZQ抗性蟲體共有40種差異表達(dá)蛋白質(zhì),其中有31種蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào),6種蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào),另有3種蛋白質(zhì)變化趨勢無法確定。表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)中有3種為兩種蟲體共有,有28種只在PZQ抗性蟲體蛋白質(zhì)雙向凝膠上篩選得到。這些蛋白分別歸類于細(xì)胞結(jié)構(gòu)及運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白(9種)、應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白(4種)、參與蟲體代謝的酶類(7種)、蛋白質(zhì)翻譯和結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)蛋白(5種)、離子調(diào)節(jié)蛋白(3種)和一些功能未知蛋白(12種)。結(jié)論:PZQ持續(xù)壓力下可使日本血吸蟲蛋白質(zhì)水平發(fā)生明顯改變,提示PZQ持續(xù)壓力可能促進(jìn)或抑制了蟲體特定基因的表達(dá),差異表達(dá)蛋白可能與藥物作用靶點(diǎn)有關(guān)。目的:通過測定日本血吸蟲PZQ抗性蟲體與未誘導(dǎo)蟲體m RNA相對表達(dá)量,分析兩者在轉(zhuǎn)錄水平的差異,并結(jié)合蛋白質(zhì)水平的差異進(jìn)行綜合分析,為探索PZQ抗蟲機(jī)理、蟲體抗藥機(jī)制,研發(fā)新藥和疫苗,建立實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:收集PZQ抗性蟲體和未誘導(dǎo)蟲體,使用TRIzol法分別抽提兩種蟲體的總m RNA,逆轉(zhuǎn)錄得到c DNA。根據(jù)差異蛋白質(zhì)登錄號在NCBI上搜索對應(yīng)基因序列,設(shè)計(jì)引物,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對c DNA進(jìn)行相對定量,進(jìn)而分析兩種蟲體的轉(zhuǎn)錄水平差異。結(jié)果:PZQ抗性蟲體中核糖體蛋白/大亞基和鈣調(diào)節(jié)蛋白基因的m RNA相對表達(dá)量較未誘導(dǎo)蟲體均下降,組蛋白H2A和熱休克蛋白70基因的m RNA相對表達(dá)量升高,差異均具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);而珠蛋白-3、磷酸丙糖異構(gòu)酶、真核翻譯延長因子1α2和肌球蛋白等基因的m RNA相對表達(dá)量與未誘導(dǎo)蟲體無明顯差異(P0.05)。所檢測的8種基因中有7種在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平的差異變化存在不一致性,只有組蛋白H2A基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平的差異變化一致,均表達(dá)上調(diào)。結(jié)論:經(jīng)PZQ壓力誘導(dǎo)的日本血吸蟲抗藥性蟲體可發(fā)生轉(zhuǎn)錄水平的改變,且在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平發(fā)生的變化不完全一致。
【關(guān)鍵詞】：日本血吸蟲 吡喹酮 抗藥性 衍生物 Ahnak 蛋白質(zhì)組學(xué) 轉(zhuǎn)錄水平
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R383.24
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-14
• 研究背景14-18
• 參考文獻(xiàn)15-18
• 第一部分 PZQ衍生物P96 及DW315 對日本血吸蟲PZQ抗性蟲體的生物學(xué)效應(yīng)觀察18-29
• 材料與方法18-20
• 1 材料18
• 1.1 陽性釘螺與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物18
• 1.2 藥物與試劑18
• 2 方法18-20
• 2.1 藥物與試劑配制18-19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立19
• 2.3 日本血吸蟲體外培養(yǎng)19-20
• 2.4 體外培養(yǎng)日本血吸蟲活力觀察20
• 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理20
• 結(jié)果20-25
• 1 PZQ、P96 和DW315 抗日本血吸蟲成蟲的生物學(xué)效應(yīng)20-21
• 2 誘導(dǎo)蟲體對PZQ、P96 和DW315 的敏感性觀察21-22
• 3 未誘導(dǎo)蟲體和PZQ抗性蟲體的形態(tài)與活力觀察22-25
• 3.1 未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)蟲體經(jīng)PZQ、P96 和DW315 作用后即時(shí)形態(tài)學(xué)觀察22-24
• 3.2 未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)蟲體經(jīng)PZQ、P96 和DW315 作用 72h后的形態(tài)學(xué)觀察24-25
• 討 論25-27
• 參考文獻(xiàn)27-29
• 第二部分 鈣通道Β亞單位相關(guān)作用蛋白AHNAK在日本血吸蟲中的初步研究29-38
• 材料與方法29-31
• 1 材料29-30
• 1.1 陽性釘螺與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物29
• 1.2 藥物與試劑29-30
• 2 方法30-31
• 2.1 藥物與試劑配制30
• 2.2 日本血吸蟲感染小鼠模型的建立30
• 2.3 日本血吸蟲成蟲體外培養(yǎng)30
• 2.4 體外培養(yǎng)日本血吸蟲活力觀察30-31
• 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析31
• 結(jié)果31-35
• 1 不同濃度AHNAK抗體拮抗PZQ體外抗日本血吸蟲成蟲效應(yīng)31-32
• 2 不同預(yù)孵育時(shí)間AHNAK抗體拮抗PZQ體外抗日本血吸蟲成蟲效應(yīng)32-35
• 討論35-36
• 參考文獻(xiàn)36-38
• 第三部分 日本血吸蟲PZQ抗性蟲體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析38-58
• 材料與方法38-48
• 1 材料38-43
• 1.1 陽性釘螺與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物38
• 1.2 藥物與試劑38-39
• 1.3 主要試劑的配制39-43
• 1.4 主要儀器43
• 2 方法43-48
• 2.1 日本血吸蟲PZQ抗性蟲體的誘導(dǎo)及獲得方法參見第一部分。43
• 2.2 蟲體總蛋白的提取43
• 2.3 蛋白質(zhì)定量43-44
• 2.4 蛋白質(zhì)純化44-45
• 2.5 雙向凝膠電泳分析45-48
• 結(jié)果48-53
• 1 2D-PAGE分析48-50
• 2 LC-MS/MS分析50-53
• 討論53-55
• 參考文獻(xiàn)55-58
• 第四部分 日本血吸蟲PZQ抗性蟲體的轉(zhuǎn)錄水平分析58-67
• 材料與方法58-61
• 1 材料58-59
• 1.1 陽性釘螺與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物58
• 1.2 藥物與試劑58
• 1.3 主要儀器58-59
• 2 方法59-61
• 2.1 日本血吸蟲PZQ抗性蟲體的誘導(dǎo)及獲得方法參見第一部分。59
• 2.2 蟲體總RNA的抽提及逆轉(zhuǎn)錄59-60
• 2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR60-61
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理61
• 結(jié)果61-63
• 1 PZQ抗性蟲體與未誘導(dǎo)蟲體MRNA相對定量分析61-62
• 2 PZQ抗性蟲體與未誘導(dǎo)蟲體的蛋白質(zhì)水平和轉(zhuǎn)錄水平差異比較62-63
• 討論63-65
• 參考文獻(xiàn)65-67
• 全文小結(jié)67-68
• 綜述：寄生蟲藥物抗性機(jī)制的研究進(jìn)展68-80
• 參考文獻(xiàn)76-80
• 攻讀學(xué)位期間本人出版或公開發(fā)表的論著、論文80-81
• 附錄一 縮寫詞表81-82
• 附錄二 主要儀器與設(shè)備82-83
• 致謝83-84

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 吳亮;田德英;;晚期血吸蟲病的中西醫(yī)結(jié)合診療[J];臨床肝膽病雜志;2015年01期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 康乃馨;白頭翁皂苷單體抗日本血吸蟲及曼氏血吸蟲的活性和作用機(jī)制的研究[D];蘇州大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：吡喹酮（PZQ）衍生物對日本血吸蟲PZQ抗性蟲體的生物學(xué)效應(yīng)及PZQ抗性蟲體蛋白質(zhì)組學(xué)分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：393413