纖毛是細(xì)胞表面突起的亞細(xì)胞區(qū)域,根據(jù)軸絲微管骨架結(jié)構(gòu)9+2和9+0的差別可分為運(yùn)動(dòng)纖毛和初級纖毛(Primary Cilium,PC)^[1]。PC因不含有中央微管軸絲,所以不具有運(yùn)動(dòng)功能。PC廣泛存在于脊椎動(dòng)物細(xì)胞中,研究顯示每個(gè)細(xì)胞有且僅有一根PC^[2]。研究證明PC參與多個(gè)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控,如Hedgehog(Hh)、PDGF和WNT信號通路的調(diào)控^[3]。Hh信號通路是一個(gè)在脊椎動(dòng)物中高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,在動(dòng)物早期胚胎發(fā)育、形態(tài)建成以及個(gè)體物質(zhì)能量代謝穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮著重要作用^[4]。然而目前對PC在調(diào)節(jié)Hh通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制并不明確。我們前期研究認(rèn)為PC中的PKA活性可能是調(diào)控Hh信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵,對該假設(shè)的驗(yàn)證需要能夠在細(xì)胞層面監(jiān)控PC中PKA活性以及其它細(xì)胞內(nèi)可能參與信號傳導(dǎo)的分子,如Ca²⁺等。然而目前對PC區(qū)域內(nèi)信號分子檢測缺乏有效的研究方法和研究材料,使得無法精細(xì)解析PC在調(diào)控Hh信號通路作用以及與PC相關(guān)其他信號通路的分子機(jī)制。為了解決上述研究的瓶頸...

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 綜述
    1.1 纖毛
        1.1.1 纖毛的結(jié)構(gòu)和功能
    1.2 初級纖毛(Primary Cilium)
    1.3 Hedgehog信號通路
    1.4 初級纖毛和Hedgehog信號通路的關(guān)系以及Hh通路研究的難點(diǎn)
    1.5 FRET檢測PKA活性的研究情況
    1.6 斑馬魚模式動(dòng)物
    1.7 本研究的內(nèi)容和意義
第二章 zNPHP3 N端肽段作為初級纖毛定位信號肽的功能驗(yàn)證
    引言
    2.1 材料與方法
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1.4.1目的基因克隆實(shí)驗(yàn)
            2.1.4.2膠回收實(shí)驗(yàn)
            2.1.4.3 Gibson Assembly連接反應(yīng)
            2.1.4.4 測序結(jié)果分析與質(zhì)粒提取
            2.1.4.5 體外轉(zhuǎn)錄
            2.1.4.6 顯微注射
            2.1.4.7 胚胎免疫熒光染色
    2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.2.1 斑馬魚zNphp3 基因的生物信息學(xué)分析
        2.2.2 斑馬魚全長蛋白z Nphp3 和截短多肽zNphp3N的亞細(xì)胞定位情況
            2.2.2.1 斑馬魚zNphp3 全長蛋白可以定位初級纖毛
            2.2.2.2 斑馬魚zNphp3N截短多肽可以定位初級纖毛
    2.3 討論
第三章 穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因品系的構(gòu)建及品系鑒定
    引言
    3.1 材料與方法
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 引物設(shè)計(jì)
        3.1.5 實(shí)驗(yàn)方法
            3.1.5.1 載體構(gòu)建
            3.1.5.2 遺傳篩選
            3.1.5.3 胚胎免疫熒光染色
            3.1.5.4 原位雜交
    3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.2.1 獲得穩(wěn)定斑馬魚轉(zhuǎn)基因品系
        3.2.3 穩(wěn)定斑馬魚轉(zhuǎn)基因品系初級纖毛的標(biāo)記情況
            3.2.3.1 穩(wěn)定斑馬魚轉(zhuǎn)基因品系初級纖毛成功標(biāo)記mCherry和 AKAR
        3.2.4 原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            3.2.4.1 原位雜交探針ptch2在AB型與轉(zhuǎn)基因斑馬魚中的表達(dá)信息
            3.2.4.2 原位雜交探針olig2在AB型與轉(zhuǎn)基因斑馬魚中的表達(dá)信息
    3.3 討論
第四章 AKAR2 的功能驗(yàn)證
    引言
    4.1 材料與方法
        4.1.1 主要試劑
        4.1.2 主要儀器
        4.1.3 實(shí)驗(yàn)方法
    4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.2.1 PKA生物傳感器建立成功
        4.2.2 PKA在 Hh信號通路中的功能分析
    4.3 討論
第五章 Hh通路異常疾病Gorlin綜合癥致病機(jī)制的研究
    引言
    5.1 研究對象與實(shí)驗(yàn)方法
        5.1.1 研究對象
        5.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            5.1.2.1 臨床病例分析
            5.1.2.2 血液基因組DNA的提取
            5.1.2.3 全外顯子測序
            5.1.2.4 Sanger測序驗(yàn)證突變位點(diǎn)
    5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.2.1 臨床病理特征分析
        5.2.2 先證者的家系圖
        5.2.3 家系成員PTCH1 突變的鑒定
    5.3 討論
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個(gè)人簡況及聯(lián)系方式



本文編號：3844001