本文關(guān)鍵詞：間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法改良及其誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞的機(jī)制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有自我復(fù)制和多向分化潛能的干細(xì)胞。其在臨床上應(yīng)用廣泛,可用于治療GVHD(Graft-versus-host disease)、促進(jìn)造血重建等。此外,間充質(zhì)干細(xì)胞還可以抑制異種抗原刺激所致的淋巴細(xì)胞反應(yīng)、促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞生成等,具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用。并且,近期研究發(fā)現(xiàn),其不但對特異性免疫應(yīng)答具有重要的調(diào)節(jié)作用,對非特異性免疫應(yīng)答細(xì)胞亦具有調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn),其可能參與“調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞”的形成,但是目前對其作用機(jī)制尚不明確。間充質(zhì)干細(xì)胞已成為干細(xì)胞領(lǐng)域研究的重點,具有廣闊的應(yīng)用前景,但是目前常用的體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法容易導(dǎo)致其干性降低、細(xì)胞凋亡以及衰老。因此,本課題擬尋找一種可以維持間充質(zhì)干細(xì)胞干性,降低其凋亡、延緩衰老進(jìn)程的培養(yǎng)方法;并對其與樹突狀細(xì)胞之間相互作用的機(jī)制進(jìn)行初步探討。方法:將殼聚糖溶解于醋酸后涂覆于培養(yǎng)板表面,在60℃烘箱中完全烘干,形成殼聚糖薄膜。后將分離出的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以同等密度接種于涂覆有殼聚糖的培養(yǎng)板和普通未經(jīng)處理的培養(yǎng)板上,培養(yǎng)5天后收集兩組細(xì)胞檢測其干性相關(guān)標(biāo)志分子CD44、Sca-1的表達(dá)情況;分別用PI-Annexin V和Hochest33342進(jìn)行染色和標(biāo)記,用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡分析和觀察細(xì)胞凋亡的情況;最后用β-Gal細(xì)胞衰老染色試劑盒進(jìn)行染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的衰老情況。通過上述實驗分析三維球體培養(yǎng)方式對間充質(zhì)干細(xì)胞干性、凋亡和衰老的影響。為了研究間充質(zhì)干細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞之間相互作用的機(jī)制,我們收集生長狀態(tài)良好的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清,從中分離出外泌體并添加到樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)基中,通過ELISA的方法檢測樹突狀細(xì)胞分泌的IL-10的情況。將與外泌體共培養(yǎng)48h后的樹突狀細(xì)胞與小鼠淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)72h,之后用流式細(xì)胞儀分析淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+細(xì)胞即調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例以及分析T細(xì)胞增殖能力的變化。通過對樹突狀細(xì)胞分泌IL-10以及其激活T細(xì)胞能力的變化進(jìn)行分析,探討外泌體是否參與間充質(zhì)干細(xì)胞對樹突狀細(xì)胞的調(diào)節(jié)。結(jié)果:間充質(zhì)干細(xì)胞在殼聚糖薄膜上培養(yǎng)1天即開始出現(xiàn)聚集的趨勢,到第3天即呈半懸浮的三維球體狀態(tài)。通過各個實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):三維球體狀態(tài)下生長的間充質(zhì)干細(xì)胞其干性相關(guān)分子CD44和Sca-1的表達(dá)比例要明顯高于對照組,很好的保持了其干性;流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示的凋亡細(xì)胞比例以及在熒光顯微鏡下觀察的凋亡情況表明,三維球體的培養(yǎng)狀態(tài)很好的延緩了細(xì)胞的凋亡;光學(xué)顯微鏡下觀察β-Gal染色結(jié)果可以看出,對照組細(xì)胞明顯比三維球體培養(yǎng)的細(xì)胞更早的出現(xiàn)了衰老。將生長狀態(tài)良好的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體與樹突狀細(xì)胞共培養(yǎng)48h,樹突狀細(xì)胞分泌IL-10的量高于對照組;加入外泌體后,樹突狀細(xì)胞對T細(xì)胞的激活作用減弱,反而誘導(dǎo)出更多的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;并且刺激T細(xì)胞增殖的能力也有所下降。結(jié)論:間充質(zhì)干細(xì)胞近年來備受關(guān)注,目前在組織工程和細(xì)胞治療領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用。但在目前的培養(yǎng)條件下容易過早的喪失干性、凋亡和衰老,從而嚴(yán)重影響其應(yīng)用價值。我們采用殼聚糖薄膜的方法,使間充質(zhì)干細(xì)胞呈三維球體狀態(tài)生長,模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生長方式,不僅很好的保持其干性,而且減緩了凋亡和衰老的進(jìn)程,使間充質(zhì)干細(xì)胞可以更好的應(yīng)用于科研和臨床。通過分析樹突狀細(xì)胞分泌IL-10以及激活T細(xì)胞的結(jié)果,可以看出外泌體與細(xì)胞因子和細(xì)胞接觸一起參與了間充質(zhì)干細(xì)胞對樹突狀細(xì)胞的調(diào)控,可能是通過其包含的蛋白或核酸發(fā)揮了作用。間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)控的機(jī)制十分復(fù)雜,還需要更進(jìn)一步的研究。
【關(guān)鍵詞】：間充質(zhì)干細(xì)胞 三維球體培養(yǎng) 樹突狀細(xì)胞 外泌體 調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語/符號說明10-11
• 前言11-16
• 研究現(xiàn)狀、成果11-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的改良16-25
• 1.1 對象和方法16-18
• 1.1.1 實驗材料16-17
• 1.1.2 實驗方法17-18
• 1.2 結(jié)果18-21
• 1.2.1 包被殼聚糖培養(yǎng)板的制備及細(xì)胞接種18-19
• 1.2.2 三維培養(yǎng)對小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干性的作用19-20
• 1.2.3 三維培養(yǎng)對小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的影響20-21
• 1.2.4 三維培養(yǎng)對小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衰老的影響21
• 1.3 討論21-23
• 1.4 小結(jié)23-25
• 二、間充質(zhì)干細(xì)胞對樹突狀細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究25-43
• 2.1 材料和方法25-33
• 2.1.1 實驗材料25-27
• 2.1.2 實驗方法27-33
• 2.2 結(jié)果33-40
• 2.2.1 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)與鑒定33-35
• 2.2.2 小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)與鑒定35-36
• 2.2.3 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體的分離與鑒定36
• 2.2.4 外泌體對樹突狀細(xì)胞免疫調(diào)控能力的影響36-40
• 2.3 討論40-42
• 2.4 小結(jié)42-43
• 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-52
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明52-53
• 綜述53-59
• 參考文獻(xiàn)57-59
• 致謝59

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張保琴;程萬民;胡艷;;趨化因子與樹突狀細(xì)胞[J];解剖科學(xué)進(jìn)展;2006年01期

2 鄧春艷;李富榮;王新根;齊暉;文錦麗;周雅瑩;;小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對同種異體骨髓來源的樹突狀細(xì)胞分化和功能的影響[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2009年12期

  本文關(guān)鍵詞：間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法改良及其誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞的機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：384138