本文關(guān)鍵詞：6-羥基-1-氫-吲唑?qū)PTP帕金森病模型小鼠的保護(hù)作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：帕金森病(Parkinson's Disease)是以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元丟失為病理特征的神經(jīng)退行性疾病,60歲以上的老年人發(fā)病率可達(dá)1%,臨床癥狀主要有靜止性震顫、肌肉僵直、運(yùn)動(dòng)減少等,患者喪失隨意運(yùn)動(dòng)的能力,病情嚴(yán)重則可產(chǎn)生認(rèn)知障礙,嚴(yán)重影響了老年人的生活質(zhì)量。截至目前,PD的病因尚未明確,也還沒有一種藥物或者方法能有效延緩和控制病情,探討PD具體的病理機(jī)制和治療方法成為亟待解決的研究課題。據(jù)報(bào)道,PD的病理機(jī)制與環(huán)境情況、遺傳、年齡、細(xì)胞的凋亡、自身的免疫、氧化應(yīng)激、興奮性神經(jīng)毒素等相關(guān),其中與神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)的tau蛋白異常磷酸化引起了人們的關(guān)注。tau蛋白位于神經(jīng)細(xì)胞的胞質(zhì),主要集中分布在軸突和樹突的生長(zhǎng)點(diǎn),因其與神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、細(xì)胞的形態(tài)、物質(zhì)運(yùn)載、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等關(guān)系密切,使得tau蛋白成為神經(jīng)退行性疾病等有關(guān)研究范疇的熱門蛋白分子。tau蛋白的異常變化如過磷酸化、糖基化等將可導(dǎo)致tau或其他某些神經(jīng)退行性疾病有關(guān)蛋白質(zhì)的異常折疊、分子聚集,再沉積在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi),導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙以及變性和死亡。已經(jīng)發(fā)現(xiàn),多條信號(hào)傳導(dǎo)通路,如c-Jun氨基末端激酶通路、p53的激活、細(xì)胞周期再激活、GSK-3β激活、CDK5激活以及通過Bcl-2家族蛋白的信號(hào)通路等介導(dǎo)了PD黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元凋亡,而tau蛋白是上述諸通路中關(guān)鍵激酶的共同底物,其在PD患者和動(dòng)物模型中均表現(xiàn)為過度磷酸化,因此,調(diào)節(jié)tau蛋白的功能有望為PD的治療提供新思路。tau蛋白的功能主要依其磷酸化水平而變化,若tau蛋白磷酸化水平過高,其穩(wěn)定微管和支持神經(jīng)元生長(zhǎng)與發(fā)育的功能將受損。體內(nèi)磷酸化tau蛋白的激酶眾多,其中最重要的兩個(gè)激酶是：糖原合成激酶3 (GSK-3β)和細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶5(CDK5),因此,有望通過調(diào)節(jié)這兩個(gè)激酶的活性降低tau蛋白過高的磷酸化水平,以達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元的目的。本課題前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),在使用MPP+(1-methyl-4-phenylpyridinium)誘發(fā)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)凋亡所建立的PD細(xì)胞模型試驗(yàn)中,6-羥基-1-氫-吲唑可同時(shí)抑制這兩個(gè)激酶的活性,降低tau蛋白的磷酸化水平,提高了SH-SY5Y細(xì)胞的存活率。盡管我們前期的體外實(shí)驗(yàn)已充分證實(shí)6-羥基-1-氫-吲唑保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的機(jī)制為抑制GSK-3β和CDK5的活性,下調(diào)tau蛋白的磷酸化水平,但是尚未在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該化合物的作用及機(jī)制。在本課題實(shí)驗(yàn)中,我們使用MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)大劑量給藥法建立PD的動(dòng)物模型,探討6-羥基-1-氫-吲唑在動(dòng)物體內(nèi)是否仍可使tau蛋白的磷酸化水平降低和保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元。將40只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、MPTP組、MPTP+低濃度藥物組、MPTP+高濃度藥物組,每組10只。記錄小鼠腹腔注射MPTP后出現(xiàn)PD癥狀的潛伏期以及持續(xù)時(shí)間。給藥適宜天數(shù)后,使用Western blot法、ABC-DAB染色法、熒光雙染色法、行為實(shí)驗(yàn)法和HPLC法分別檢測(cè)各組小鼠中腦部位的酪氨酸羥化酶(TH)含量、黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的存活情況、多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白的磷酸化水平、行為學(xué)異常情況和紋狀體多巴胺含量。通過以上各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)明確了在使用MPTP建立的PD C57BL/6小鼠體內(nèi),6-羥基-1-氫-吲唑可抑制tau蛋白的過磷酸化,保護(hù)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元。方法1. MPTP腹腔注射建立PD動(dòng)物模型選取12周齡、雄性的C57BL/6小鼠40只,隨機(jī)分為空白對(duì)照(control)組、MPTP(M)組、MPTP+2 mg/kg 6-羥基-1-氫-吲唑(低劑量)組、MPTP+4 mg/kg 6-羥基-1-氫-吲唑(高劑量)組。實(shí)驗(yàn)第一天,低劑量組和高劑量組小鼠分別腹腔注射2 mg/kg、4mg/kg 6-羥基-1-氫-吲唑,空白組和MPTP組小鼠均腹腔注射等容積含3%DMSO的生理鹽水；第二天低劑量組和高劑量組先腹腔注射6-羥基-1-氫-吲唑,其余組腹腔注射等容積含3%DMSO的生理鹽水。30 min后低劑量組、高劑量組和M組均腹腔注射30 mg/kg MPTP,空白組腹腔注射等容量的生理鹽水,連續(xù)5天(共6天)。2.小鼠PD癥狀潛伏期和持續(xù)時(shí)間測(cè)定在MPTP注射的第二天,每只小鼠MPTP注射后仔細(xì)觀察并記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)震顫麻痹癥狀的潛伏期和維持時(shí)間。潛伏期：從腹腔注射MPTP完畢至震顫麻痹癥狀出現(xiàn)的時(shí)間；維持時(shí)間：從震顫麻痹癥狀開始出現(xiàn)至震顫麻痹癥狀完全消失時(shí)的時(shí)間。比較每組小鼠注射MPTP后震顫麻痹癥狀的潛伏期和持續(xù)時(shí)間,探討6-羥基-1-氫-吲唑是否可改善小鼠震顫麻痹癥狀。3.小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元檢測(cè)MPTP末次注射后第七天,切取黑質(zhì)致密部的351μm腦片。TBS/Triton (TritonX-100的含量為0.1%)漂洗后,用新鮮制備的含0.3 %H202的TBS處理腦片30分鐘。室溫下,用TBS/Triton漂洗腦片兩次,每次5 min;然后用3%goat血清(TBS/Triton配制)封閉腦片上的非特異結(jié)合位點(diǎn),室溫1小時(shí)。在TH抗體4℃孵育過夜后(注意保濕),TBS/Triton室溫洗兩次,每次5 min。室溫下,用生物素標(biāo)記的goat抗rabbit二抗孵育腦片2小時(shí)；期間配制ABC試劑混合溶液,至少在室溫下靜置15 min。用TBS/Triton漂洗兩次,每次5 min后,在ABC混合溶液中室溫孵育腦片1小時(shí)；用TBS/Triton洗兩次,每次5 mmin,最后在DAB中孵育腦片直到利用光學(xué)顯微鏡判斷染色是理想的(一般2-5分鐘)。用TBS漂洗腦片后,把腦片置于硅化玻片上,4℃過夜。第二天,把腦片按先后順序浸入50%,70%,80%,90%,95%和100%的乙醇中脫水,時(shí)間均為2 min;然后是乙醇/二甲苯混合溶液(1：1混合)浸泡2min；100%二甲苯浸泡透明3 min；最后以中性樹脂封片,光學(xué)顯微鏡下觀察分析拍照,室溫保存。4.小鼠中腦組織TH蛋白含量的測(cè)定MPTP末次注射后第七天,各實(shí)驗(yàn)組取小鼠一只,頸椎脫臼致死,迅速分離出腹側(cè)中腦,稱重,按500 μl/50 mg的比例加入冷Tris裂解緩沖液,低溫勻漿(冰浴),超聲破碎,12000 rpm 4℃離心30 min,取上層清液,棄沉淀,BCA法測(cè)定蛋白含量,-20℃保存,待Western blot檢測(cè)TH蛋白含量。5.小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)最后一次MPTP注射后的第十天觀察小鼠行為學(xué)改變。爬桿試驗(yàn)(pole test):將一個(gè)軟木小球(直徑為2.5厘米)固定在一根木桿(長(zhǎng)為50厘米,直徑為1厘米)頂端,小球纏上紗布(防打滑),然后將各組小鼠置于小球上,再記錄下列3個(gè)時(shí)間：小鼠在頂球上所停留的時(shí)間；小鼠爬完桿子的上半部分所耗費(fèi)的時(shí)間；小鼠爬完桿子的下半部分所耗費(fèi)的時(shí)間。最后根據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分：能在3秒內(nèi)完成以上任一動(dòng)作的小鼠記3分；能在6秒內(nèi)完成的小鼠記2分；若超過6秒的記1分。最后計(jì)算三項(xiàng)累計(jì)得分情況,并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。懸掛實(shí)驗(yàn)(traction test):將待測(cè)小鼠兩前爪懸掛在一根水平電線上,若小鼠用兩后爪抓住電線則記3分；如用一后爪抓住電線則記2分。若小鼠兩只后爪均抓不住電線則記1分,然后記錄各組小鼠得分,最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。6.高效液相色譜法測(cè)定小鼠紋狀體多巴胺含量MPTP末次注射后第十天,各實(shí)驗(yàn)組小鼠在完成行為學(xué)測(cè)試后,取雙側(cè)紋狀體稱重后,置-70℃保存。檢測(cè)當(dāng)日,將0.5ml高氯酸提取液(溶液成分：0.1 mol/L高氯酸,0.1%半胱氨酸)加入每一樣品內(nèi),在冰浴中進(jìn)行組織勻漿,18000 rpm4℃離心20 min,取上清液25-100μl進(jìn)行分析。色譜條件：510高壓泵(WATERS公司),7125進(jìn)樣器,HP1049A電化學(xué)檢測(cè)器,BDS C18色譜柱(大連依利特公司),規(guī)格4.6×250 mm,5μm粒徑。緩沖液：3 mmol/L庚烷璜酸鈉,100 mmol/L醋酸鈉,85 mmol/L檸檬酸,0.2 mmol/L EDTA, PH4.0。流動(dòng)相由緩沖液和甲醇(90：10 v/v)組成。流速：1.0 ml/min,柱溫：40℃。定性分析：以樣品的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)物保留時(shí)間對(duì)照定性。定量方法：以DHBA為內(nèi)標(biāo)物,以樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值進(jìn)行定量分析。7.小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白磷酸化水平檢測(cè)實(shí)驗(yàn)第四天,MPTP注射后6小時(shí),取腦行經(jīng)黑質(zhì)致密部的10μm切片做TH抗體和p-tau抗體的熒光雙染色實(shí)驗(yàn)。切片置于24孔板內(nèi),用TBS/Triton洗一次后,用溶于TBS/Triton的3%驢血清封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)室溫1小時(shí)。用含3%BSA的TBS溶液稀釋的第一個(gè)一抗,即特異性TH抗體,在4℃下孵育腦片過夜。第二天,用TBS/Triton漂洗兩次,每次5 min,然后用含3%BSA的TBS液稀釋的第二個(gè)一抗p-tau,37℃孵育2小時(shí)。室溫下用TBS/Triton洗兩次,每次5 min,然后用TBS洗5 min用含1%BSA的TBS以1：200的稀釋度稀釋并混合兩種熒光二抗,室溫下孵育腦片1小時(shí)。孵育盒用錫箔覆蓋避光。TBS漂洗兩次,每次10 min后,腦片置于PBS溶液中懸浮貼片。用抗熒光淬滅封片劑把腦片制成標(biāo)本。熒光顯微鏡下觀察分析拍照,最后置于4℃避光保存。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有統(tǒng)計(jì)分析均用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean± S.E.M)表示,采用LSD's t檢驗(yàn),p0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多組間比較采用單因素方差分析(one-way anova)。結(jié)果1.6-羥基-1-氫-吲唑?qū)PTP PD模型小鼠產(chǎn)生的震顫麻痹癥狀潛伏期和持續(xù)期的影響每次腹腔注射MPTP完成后,MPTP組小鼠均出現(xiàn)全身震顫,行動(dòng)遲緩,前肢向前伸展,兩后肢屈蹲,弓背豎毛,飲水和進(jìn)食困難；且隨著給藥次數(shù)的增加,癥狀逐漸加重,該組小鼠PD震顫麻痹癥狀的潛伏期和持續(xù)時(shí)間分別為1.89±0.08 min和25.58±0.51 min (P0.01)。給予6-羥基-1-氫-吲唑的兩組小鼠注射MPTP后的震顫麻痹癥狀明顯減輕,表現(xiàn)在癥狀出現(xiàn)的潛伏期延長(zhǎng),低劑量組和高劑量組分別為3.97±0.15 min和3.51±0.09 min (P0.01);癥狀的維持時(shí)間縮短,低劑量組和高劑量組分別為16.85±0.72 min和16.48±0.45 min(P0.01)�？瞻捉M小鼠活動(dòng)正常,未出現(xiàn)上述任何癥狀。2.黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元存活情況在MPTP末次注射后第七天,使用ABC法檢測(cè)各組小鼠黑質(zhì)內(nèi)殘存的多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,MPTP組小鼠雙側(cè)黑質(zhì)部位的多巴胺能神經(jīng)元大量丟失,殘留數(shù)量?jī)H為空白對(duì)照組小鼠的36.65%(P0.01)。而6-羥基-1-氫-吲唑可抑制因MPTP毒性所引起的多巴胺能神經(jīng)元凋亡。在低劑量組,小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元?dú)埩魯?shù)量明顯較MPTP組小鼠多,殘留量為空白對(duì)照組的78.61%(P0.01)。在高劑量組,小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量已接近空白組,殘留數(shù)量為空白對(duì)照組的93.63%(P0.01)。3. western blotting檢測(cè)小鼠中腦TH蛋白含量在MPTP末次注射后第七天,western blotting法檢測(cè)各組小鼠中腦部位TH蛋白的含量,結(jié)果顯示：MPTP可使小鼠中腦的TH蛋白水平顯著降低,MPTP組小鼠中腦TH蛋白的表達(dá)量?jī)H為空白對(duì)照組的45%(P0.01)。但是,6-羥基-1-氫-吲唑可明顯升高因MPTP毒性降低的TH含量,低劑量組小鼠中腦TH含量為空白對(duì)照組的60%(P0.01),高劑量組小鼠中腦TH含量可達(dá)空白組的88%(P0.01)。4.各組小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)在MPTP末次注射后的第十天,對(duì)各組小鼠實(shí)施行為學(xué)檢測(cè)。在爬桿實(shí)驗(yàn)中,MPTP組小鼠爬完上半部分和下半部分所用時(shí)間明顯比空白對(duì)照組長(zhǎng),空白對(duì)照組和MPTP組小鼠得分分別為8.0±0.3和5.1±0.4。低劑量組和高劑量組小鼠完成爬桿實(shí)驗(yàn)所用時(shí)間均明顯比MPTP組小鼠少,得分分別為7.1±0.6和7.1±0.6(P0.05)。在懸掛實(shí)驗(yàn)中,空白對(duì)照組小鼠用四肢抓住電線,得分為2.6±0.1(P0.05)；而MPTP組小鼠卻只能用前爪抓住電線,后爪無(wú)力,得分為1.7±0.1(P0.05)；6-羥基-1-氫-吲唑處理的低劑量組和高劑量組小鼠雖然有的后爪仍然運(yùn)動(dòng)受阻,但至少可以用一只后爪抓住電線,得分分別為2.4±0.1和2.2±0.2(P0.05)。5.小鼠紋狀體多巴胺濃度在MPTP末次注射后的第十天,高效液相色譜法檢測(cè)各組小鼠紋狀體內(nèi)的多巴胺濃度,結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組的紋狀體多巴胺濃度(12.54±0.27 ng/mg)相比,MPTP組的多巴胺濃度顯著降低(P0.01),為2.75±0.16 ng/mg;但是6-羥基-1-氫-吲唑處理后的小鼠紋狀體多巴胺濃度明顯比MPTP組高,低劑量組和高劑量組小鼠紋狀體多巴胺濃度分別為4.63±0.56和4.14±0.13 ng/mg (P0.01).6.黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白磷酸化水平利用TH抗體和磷酸化tau蛋白(p-tau(Ser396))抗體進(jìn)行免疫熒光雙染色實(shí)驗(yàn),檢測(cè)MPTP處理2天后的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白的磷酸化水平,進(jìn)行免疫熒光雙染色實(shí)驗(yàn),免疫組織化學(xué)的熒光雙染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,被熒光素FITC標(biāo)記的二抗結(jié)合的多巴胺能神經(jīng)元呈綠色,被熒光素Cy-3標(biāo)記的二抗結(jié)合的多巴胺能神經(jīng)元呈紅色,兩熒光圖結(jié)合后,呈橘紅色的細(xì)胞說(shuō)明多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)磷酸化tau(Ser396)表達(dá)高,仍然呈綠色的細(xì)胞說(shuō)明多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)磷酸化tau(Ser396)表達(dá)低。MPTP組小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元包漿內(nèi)有大量的p-tau(Ser396)表達(dá),熒光雙染呈橘紅色細(xì)胞數(shù)目較多,陽(yáng)性率為52.19%(P0.01)。而6-羥基-1-氫-吲唑可抑制MPTP升高的p-tau(Ser396),使低劑量組和高劑量組小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)的tau蛋白磷酸化水平降低,熒光雙染陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目減少,陽(yáng)性率分別為21.17%和17.85%(P0.01)�？瞻讓�(duì)照組小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)的tau蛋白磷酸化水平很低,陽(yáng)性率為17.58%(P0.01)。結(jié)論1.利用MPTP大劑量給藥法建立了穩(wěn)定的PD動(dòng)物模型：MPTP可升高黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)磷酸化tau水平,誘導(dǎo)黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡,使黑質(zhì)內(nèi)殘存的功能神經(jīng)元減少,紋狀體內(nèi)多巴胺含量降低,最終使小鼠肢體協(xié)調(diào)功能障礙,出現(xiàn)行為學(xué)異常；2.6-羥基-1-氫-吲唑降低黑質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)MPTP升高的tau的磷酸化水平、減少神經(jīng)元的凋亡、增加黑質(zhì)內(nèi)殘余神經(jīng)元的數(shù)目、增加紋狀體內(nèi)多巴胺含量,并且改善PD小鼠的行為學(xué)變化；3.我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為研究開發(fā)抗PD藥物提供了一個(gè)新策略,那就是“抑制tau過度磷酸化”。
【關(guān)鍵詞】：6-羥基-1-氫-吲唑 多巴胺能神經(jīng)元 tau蛋白 MPTP 帕金森病
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R965;R-332
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-22
• 前言22-30
• 1.1 材料與儀器30-34
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法34-42
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-51
• 1.4 實(shí)驗(yàn)討論51-55
• 1.5 結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-65
• 縮略詞表65-66
• 攻讀學(xué)位期間成果66-67
• 致謝67-69

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 張如意,張?zhí)m,葉翠飛,李林;MPTP對(duì)小鼠行為學(xué)及腦紋狀體多巴胺含量的影響[J];中國(guó)行為醫(yī)學(xué)科學(xué);2001年03期

  本文關(guān)鍵詞：6-羥基-1-氫-吲唑?qū)PTP帕金森病模型小鼠的保護(hù)作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：382159