目的在懸浮CHO-S細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(recombinant human bone morphgenetic protein7,rhBMP7)成熟蛋白。方法應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從BALB/c乳鼠股骨組織擴(kuò)增mbmp7基因,克隆至質(zhì)粒pMD18-T,通過定點(diǎn)突變3個(gè)氨基酸編碼序列(G266S、S287N、D359E),得到重組克隆質(zhì)粒pMD18-mbmp7_m3;將mbmp7_m3克隆至表達(dá)載體pCHO1. 0,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pCHO-mbmp7_m3,轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞,利用嘌呤霉素和甲氨蝶呤進(jìn)行兩輪加壓篩選,有限稀釋法篩選單克隆細(xì)胞,ELISA法檢測(cè)rhBMP7成熟蛋白的表達(dá)。結(jié)果從乳鼠股骨組織擴(kuò)增的cDNA經(jīng)測(cè)序與GenBank中登錄的序列完全一致,點(diǎn)突變后測(cè)序與設(shè)計(jì)完全一致。獲得了穩(wěn)定表達(dá)rhBMP7成熟蛋白的單克隆細(xì)胞株,最高表達(dá)量為202 ng/mL。結(jié)論成功利用改造的mbmp7基因在CHO-S細(xì)胞中表達(dá)了rhBMP7成熟蛋白,為后續(xù)該制品工藝開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    1.2 菌株、質(zhì)粒及細(xì)胞株
    1.3 主要試劑
    1.4 引物設(shè)計(jì)及合成
    1.5 mbmp7的獲取
    1.6 mbmp7基因的定點(diǎn)突變改造
    1.7重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
    1.8 rhBMP-7 CHO細(xì)胞株的獲得
        1.8.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
        1.8.2 單克隆的篩選
        1.8.3 單克隆細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)
        1.8.4 單克隆產(chǎn)量的初步評(píng)估
2 結(jié)果
    2.1 mbmp7基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定
    2.2 重組克隆質(zhì)粒的鑒定
    2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
    2.4 rhBMP7的CHO細(xì)胞株單克隆初篩結(jié)果
    2.5 rhBMP7的CHO細(xì)胞株搖瓶篩選結(jié)果
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