本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌cAMP誘導(dǎo)基因Rv1265在胞內(nèi)存活中的作用與分子機理，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：據(jù)2013World Health Organization Tuberculosis Data and Statistics報道,結(jié)核病每年導(dǎo)致1.3million死亡,新增8.6 million感染病例。由于藥物的廣泛濫用及亂用,使得結(jié)核病死灰復(fù)燃,嚴重危害著人類的健康,尤其是與HIV免疫缺陷病人共感染。多重耐藥菌(mutiple-drug resistance)和廣泛耐藥菌(extensive-drug resistance)的出現(xiàn)使得結(jié)核病的治療更加困難。因此尋找結(jié)核分枝桿菌的新的藥物靶標,篩選并開發(fā)新型抗結(jié)核藥物。目前結(jié)核分枝桿菌存在許多功能未知的保守蛋白,而這些蛋白對于結(jié)核分枝桿菌在宿主中的存活是否存在一定關(guān)聯(lián),這些都需要做進一步的探討。因此本文主要以恥垢分枝桿菌為模型,探索cAMP應(yīng)答基因rv1265在結(jié)核分枝桿菌毒力中的作用。本研究成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pALACE-Rv1265,將其電轉(zhuǎn)到恥垢分枝桿菌后通過抗生素篩選和菌液PCR的方法鑒定重組菌株Ms_Rv1265構(gòu)建成功。以實驗室現(xiàn)存的空載菌株Ms_vector為對照,western blotting成功檢測到Ms_Rv1265菌株中帶有His標簽的Rv1265蛋白表達,而空載菌(Ms_Vec)在相應(yīng)的位置上沒有條帶。利用96孔板檢測Rv1265的過表達菌株對臨床上常用的抗結(jié)核藥物的耐受情況,發(fā)現(xiàn)與Ms_Vec相比Ms_Rv1265對抗生素的耐受性并沒有影響。生長曲線測定發(fā)現(xiàn)Ms_Rv1265和Ms_Vec的生長沒有差異,說明Rv1265的過表達不會影響恥垢分枝桿菌的生長。細胞亞定位發(fā)現(xiàn)Rv1265蛋白定位在重組菌的細胞壁和細胞質(zhì)中推測該蛋白可能會改變重組菌的細胞壁性質(zhì)。因此我們提取Ms_Rv1265和Ms_Vec的脂肪酸,發(fā)現(xiàn)重組菌細胞壁的脂肪酸含量明顯高于空載菌,尤其是C10：0,MeC13:0, MeC14:0, C15:0, MeC15:0, C16:1We7(c), MeC16:0,3MeC16:0, C24:1W9(c)和C26：0的含量顯著性上調(diào),據(jù)此我們推測Rv1265可能參與了恥垢分枝桿菌脂肪酸的合成。C26：0是分枝菌酸高溫分解的產(chǎn)物之一,而重組菌中C26：0的增多也可能是因為重組菌中分枝菌酸的含量增多引起的。體外模擬重組菌Ms_Rv1265和Ms Vec在表面活性物質(zhì)SDS和不同酸性條件下的存活,發(fā)現(xiàn)重組菌在0.1% SDS處理下具有較強的存活率,并且相對于空載菌具有顯著性差異。在PH=3的7H9培養(yǎng)基里培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)與Ms_Vec相比,Ms_Rv1265具有較強的存活率,而在PH=5的條件下,兩者沒有顯著性差異。為了進一步探索Rv1265蛋白的毒力作用,利用Ms_Rv1265和Ms_Vec侵染THP-1細胞和Raw264.7細胞,發(fā)現(xiàn)Ms_Rv1265在巨噬細胞內(nèi)的存活能力相對于Ms_Vec具有顯著性提高,LDH釋放量檢測發(fā)現(xiàn)與Ms_Vec相比Ms_Rv1265可以促進THP-1巨噬細胞的裂解。同時提取Raw264.7和THP-1細胞的總RNA,檢測相關(guān)的細胞因子IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12P40和TNF-a,以及炎癥相關(guān)的caspase-1和促凋亡因子bcl-rambo的轉(zhuǎn)錄水平。發(fā)現(xiàn)與Ms_Vec相比Ms_Rv1265侵染后在Raw264.7和THP-1細胞中細胞因子IL-1β,IL-12P40, IL-10和IL-6均上調(diào)表達。利用特異性的信號通路抑制劑處理侵染了Ms_Rv1265和Ms_Vec的細胞THP-1,發(fā)現(xiàn)NF-κB和1/2ERK途徑對于特異性誘導(dǎo)IL-1β, IL-12P40, IL-10和IL-6的上調(diào)表達具有非常重要的作用。綜上所述,本文主要研究了cAMP應(yīng)答基因Rv1265的功能,發(fā)現(xiàn)與空載菌相比,過表達菌株Ms_Rv1265對胞外壓力的耐受能力增強,并通過干擾宿主細胞的細胞因子表達來增強其在巨噬細胞的存活。此外,Rv1265的過表達改變了恥垢分枝桿菌中細胞壁的脂肪酸成分。以上結(jié)果表明Rv1265極有可能是結(jié)核分枝桿菌的毒力基因,這將為研究結(jié)核分枝桿菌與宿主相互作用網(wǎng)絡(luò)提供了線索。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 cAMP Rv1265 巨噬細胞 細胞因子
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R378.911
【目錄】：

• 摘要9-11
• Abstract11-13
• 第1章 綜述13-21
• 1.1 cAMP的合成13-14
• 1.2 腺苷酸環(huán)化酶14
• 1.3 磷酸二酯酶14-15
• 1.4 cAMP效應(yīng)蛋白15
• 1.5 cAMP應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子15-16
• 1.6 細菌致病菌中cAMP的作用16-21
• 1.6.1 致病細菌的cAMP信號17-19
• 1.6.2 致病真菌中cAMP信號19
• 1.6.3 寄生原蟲中cAMP信號19-21
• 第2章 前言21-23
• 第3章 實驗材料和方法23-39
• 3.1 實驗材料23-25
• 3.1.1 實驗菌株,載體和細胞23
• 3.1.2 所用培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件23-24
• 3.1.3 主要試劑24-25
• 3.1.4 主要儀器25
• 3.2 實驗方法25-39
• 3.2.1 結(jié)核分枝桿菌Rv1265基因的擴增25-26
• 3.2.2 Rv1265 PCR產(chǎn)物的回收26
• 3.2.3 制備大腸桿菌感受態(tài)細胞26
• 3.2.4 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化26
• 3.2.5 Rv1265基因與T載質(zhì)粒的構(gòu)建26-27
• 3.2.6 重組質(zhì)粒的提取27
• 3.2.7 Rv1265+pALACE重組質(zhì)粒的構(gòu)建27-28
• 3.2.8 Rv1265重組蛋白在大腸桿菌中的表達和純化28-29
• 3.2.9 Rv1265重組恥垢分枝桿菌的構(gòu)建29-30
• 3.2.10 重組蛋白在恥垢分枝桿菌中的表達驗證30-31
• 3.2.11 Rv1265重組蛋白在恥垢分枝桿菌中的亞細胞定位分析31
• 3.2.12 重組恥垢分枝桿菌Ms Rv1265對SDS耐受的影響31
• 3.2.13 體外模擬重組恥垢分枝桿菌Ms Rv1265在不同PH條件下的存活率31-32
• 3.2.14 重組恥垢分枝桿菌脂肪酸提取和測定32
• 3.2.15 重組菌生長曲線的測定32-33
• 3.2.16 重組菌侵染巨噬細胞存活率檢測33-34
• 3.2.17 定量RT-PCR檢測重組菌侵染Raw264.7和THP-1巨噬細胞后相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄水平34-36
• 3.2.18 LDH測定36
• 3.2.19 細胞信號通路抑制劑處理細胞36
• 3.2.20 恥垢分枝桿菌ΔMSMEG5010基因的敲除36-38
• 3.2.21 數(shù)據(jù)處理38-39
• 第4章 結(jié)果與分析39-55
• 4.1 成功構(gòu)建重組質(zhì)粒Rv1265+pALACE39-40
• 4.2 構(gòu)建重組恥垢分枝桿菌Ms_Rv126540
• 4.3 Rv1265蛋白在大腸桿菌BL-21中成功表達40-41
• 4.4 Rv1265在恥垢分枝桿菌Ms_Rv1265中成功表達41
• 4.5 Rv1265定位于細胞壁和細胞質(zhì)41-42
• 4.6 Rv1265的過表達不影響菌株的生長42-43
• 4.7 Rv1265的過表達增強了菌株在酸性條件下的存活率43
• 4.8 Rv1265參與恥垢分枝桿菌脂肪酸代謝43-45
• 4.9 Rv1265可以增強重組菌對于表面活性物質(zhì)SDS的耐受45-46
• 4.10 重組菌Ms_Rv1265在巨噬細胞存活的影響46-48
• 4.10.1 Rv1265有利于重組菌在THP-1細胞的存活,并且可以促進細胞裂解46-47
• 4.10.2 重組菌Ms Rv1265增強在Raw264.7巨噬細胞內(nèi)的存活47-48
• 4.11 Rv1265在恥垢分枝桿菌的過表達會促進THP-1細胞死亡48
• 4.12 Rv1265的過表達可以特異性誘導(dǎo)THP-1細胞免疫調(diào)節(jié)細胞因子的表達48-49
• 4.13 重組菌Ms_Rv1265特異性誘導(dǎo)Raw264.7的免疫調(diào)控因子IL-10,IL-12和IL-1β和IL-6上調(diào)表達49-51
• 4.14 Ms_Rv1265通過NF-B和ERK1/2通路調(diào)控IL-1β,IL-10,IL-12P40,IL-651-52
• 4.15 構(gòu)建恥垢分枝桿菌同源基因MSMEG5010的敲除菌株52-53
• 4.16 △MS5010對諾氟沙星敏感53-55
• 第5章 結(jié)論與展望55-59
• 5.1 實驗結(jié)論55
• 5.2 討論與分析55-57
• 5.3 展望57-59
• 參考文獻59-65
• 致謝65-67
• 在學(xué)期間所發(fā)表的文章67

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1 羅紅萍;結(jié)核分枝桿菌cAMP誘導(dǎo)基因Rv1265在胞內(nèi)存活中的作用與分子機理[D];西南大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌cAMP誘導(dǎo)基因Rv1265在胞內(nèi)存活中的作用與分子機理，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：380274