發(fā)布時(shí)間：2017-05-17 18:26

  本文關(guān)鍵詞：IRAK2-Smurf1信號軸在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)的修飾、加工、合成以及肽鏈的折疊和組裝運(yùn)輸?shù)闹饕獔鏊?內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過對蛋白質(zhì)的加工和修飾積極的參與到諸如細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)血糖的濃度、鈣離子平衡的調(diào)節(jié)、合成膜脂以及合成激素等多種生理活動(dòng)當(dāng)中。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)合成的蛋白質(zhì)得不到及時(shí)的轉(zhuǎn)運(yùn)、非折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量的積聚,又或者受到饑餓、缺氧、藥物影響、鈣離子平衡被打破等各種因素導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能受損。目前已經(jīng)證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與阿爾茨海默病、糖尿病、腎小管損傷、帕金森氏病、肝臟病毒性損傷和酒精性損傷等眾多疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要包括未折疊蛋白反應(yīng)和鈣離子信號等幾大類。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡被嚴(yán)重破壞時(shí),細(xì)胞質(zhì)中依賴鈣離子的鈣蛋白酶(calpain)被激活并尋找到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Procaspasel2,將其剪切并活化,隨后通過一系列信號傳導(dǎo)最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡程序啟動(dòng)：當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的合成、折疊、修飾蛋白質(zhì)功能受損而引起大量非折疊和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)積聚,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會(huì)啟動(dòng)一系列補(bǔ)救措施試圖糾正這些錯(cuò)誤蛋白質(zhì),最終會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成功能下降、降解能力增強(qiáng)、發(fā)生細(xì)胞凋亡等一系列后續(xù)反應(yīng),這些由于積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的未經(jīng)修飾的蛋白和錯(cuò)誤折疊的蛋白多引發(fā)的反應(yīng)就是未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)。而當(dāng)發(fā)生未折疊蛋白反應(yīng)時(shí),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可以通過激活I(lǐng)RE1、ATF6和PERK三條信號傳導(dǎo)通路,此時(shí)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會(huì)自我保護(hù)性的減少新蛋白的翻譯及生成、加強(qiáng)對錯(cuò)誤折疊蛋白的降解來使自己重新恢復(fù)生理平衡,但過度的激活這三條通路都會(huì)不可避免的導(dǎo)致細(xì)胞啟動(dòng)凋亡程序泛素化是指在酶促級聯(lián)反應(yīng)的作用下,泛素分子標(biāo)記在底物蛋白的過程。泛素化參與了細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、損傷修復(fù)、炎癥免疫等諸多生命活動(dòng)。泛素一蛋白酶體途徑是泛素發(fā)揮上述蛋白質(zhì)降解功能的主要途徑,主要由泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2以及泛素蛋白連接酶E3、去泛素化酶、26S蛋白酶體構(gòu)成。機(jī)體內(nèi)的E3主要分為兩大類：RING類E3以及HECT類E3,而目前對HECT類E3研究較多的是Nedd4家族。Nedd4家族在TNF-α、TGF-β以及BMP等多條信號傳導(dǎo)通路中起著不可或缺的調(diào)控功能。Smad泛素化調(diào)節(jié)因子1(Smurf1)是Nedd4家族中的一員,深入研究Smurf1后發(fā)現(xiàn)其不光在微觀層面對細(xì)胞生長和形態(tài)學(xué)改變、細(xì)胞遷移、細(xì)胞極性以及細(xì)胞的自我吞噬功能中起著重要的作用并且在骨形成、胚胎發(fā)育以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等宏觀生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的生理學(xué)功能。2005年時(shí),一篇發(fā)表在Science雜志上的研究中,作者根據(jù)從大規(guī)模篩選結(jié)果,發(fā)現(xiàn)野生型和酶活突變型Smurf1與IRAK2相互作用預(yù)測分值很高,提示我們IRAK2可能和Smurf1以及TGF-B通路存在著交互作用,但究竟其具有何種生理影響等科學(xué)問題均未給與解答。白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶(IRAKs)是Toll樣受體信號途徑中的關(guān)鍵調(diào)控分子。IRAK家族包括4個(gè)成員：IRAK1、IRAK2、IRAK3 (IRAK-M) 以及 IRAK4。家族成員都含有一個(gè)死亡結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)與、域可以與MyD88死亡結(jié)構(gòu)域相互作用的。IRAK2廣泛存在于各種人體組織中。在Toll樣受體信號通路中,發(fā)揮著承上啟下調(diào)控信號傳遞的作用,是固有免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)免疫應(yīng)答不可缺少的關(guān)鍵激酶。我們對IRAK2和Smurf1之間的相互作用、作用方式和意義進(jìn)行了深入細(xì)致的研究。首先我們構(gòu)建了人源Smurf1和IRAK2的真核表達(dá)載體,并且進(jìn)行了免疫共沉淀相互作用實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)Smurf1確實(shí)可以和IRAK2進(jìn)行相互作用；隨后通過不同種屬來源的Smurf1和IRAK2的內(nèi)源抗體檢測,發(fā)現(xiàn)smurf1和IRAK2在內(nèi)源條件下也是存在相互作用的；并通過共定位和構(gòu)建Smurf1截短體證實(shí)了在細(xì)胞中IRAK2與Smurf1是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)這一結(jié)構(gòu)上發(fā)生相互作用的；隨后通過相互作用區(qū)域?qū)嶒?yàn)證實(shí)Smurf1與IRAK2的相互作用主要是通過HECT結(jié)構(gòu)域來完成的。之后我們通過過量表達(dá)實(shí)驗(yàn)卻發(fā)現(xiàn)雖然IRAK2對Smurf1的蛋白水平負(fù)調(diào)依賴于蛋白酶體途徑,但Smurf1并不是IRAK2的泛素連接酶E3,我們通過用慢病毒載體包裝病毒后構(gòu)建穩(wěn)定株也顯示敲低IRAK2后Smurf1蛋白水平上調(diào),說明IRAK2對Smurf1的蛋白水平具有負(fù)調(diào)節(jié)效應(yīng),于是我們構(gòu)建了IRAK2缺失酶活催化結(jié)構(gòu)域的截短體,并進(jìn)行了磷酸化水平檢測。發(fā)現(xiàn)IRAK2可以明顯的促進(jìn)smurf1蘇氨酸的磷酸化,并且的確磷酸化發(fā)生在HECT結(jié)構(gòu)域中的Thr114, Thr128, Thr437三個(gè)位點(diǎn)的蘇氨酸。結(jié)合共定位實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,我們設(shè)想IRAK2對Smurf1的負(fù)調(diào)控功能可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的相關(guān)功能有聯(lián)系。于是檢測了毒胡蘿卜素(Thapsigargin)刺激情況下的IRAK2介導(dǎo)的ER stress通路和smurf1介導(dǎo)的ER stress通路的響應(yīng)情況,發(fā)現(xiàn)確實(shí)IRAK2和Smurf1呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)：隨后我們再次檢測了敲低IRAK2細(xì)胞株中Smurf1介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的信號通路動(dòng)態(tài)變化,結(jié)果顯示敲低IRAK2的細(xì)胞株,Smurf1下游的WFS1以及ATF6的蛋白含量變化,證明IRAK2確實(shí)通過Smurf1調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)應(yīng)激信號通路。
【關(guān)鍵詞】：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 磷酸化 IRAK2 Smurf1
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 中英文縮略語對照表12-13
• 第一章 前言13-17
• 第一節(jié) 泛素—蛋白酶體途徑13-15
• 第二節(jié) HECT類泛素連接酶及其成員Smurf1的結(jié)構(gòu)15-17
• 第二章 IRAK-2與泛素連接酶Smurf 1之間的相互作用17-27
• 第一節(jié) 背景資料17-21
• 第二節(jié) 材料與方法21-22
• 第三節(jié) 結(jié)果與討論22-27
• 第三章 IRAK-2對泛素連接酶Smurf 1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的調(diào)控27-36
• 第一節(jié) 背景資料27-31
• 第二節(jié) 材料與方法31
• 第三節(jié) 結(jié)果與討論31-36
• 第四章 討論36-39
• 參考文獻(xiàn)39-45
• 附錄45-56
• 附錄1 實(shí)驗(yàn)常用方法詳細(xì)流程步驟45-50
• 附錄2 引物的設(shè)計(jì)與酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)50-51
• 附錄3 實(shí)驗(yàn)主要使用材料來源、試劑配制及常用儀器設(shè)備51-56
• 文獻(xiàn)綜述56-70
• 參考文獻(xiàn)66-70
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況70-71
• 致謝71-72

【相似文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉兢文;IRAK2-Smurf1信號軸在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的功能研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2015年

  本文關(guān)鍵詞：IRAK2-Smurf1信號軸在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：374185