本文關鍵詞：IRAK2-Smurf1信號軸在內質網應激中的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：內質網是蛋白質的修飾、加工、合成以及肽鏈的折疊和組裝運輸的主要場所,內質網通過對蛋白質的加工和修飾積極的參與到諸如細胞凋亡、調節(jié)血糖的濃度、鈣離子平衡的調節(jié)、合成膜脂以及合成激素等多種生理活動當中。內質網應激是指當內質網內合成的蛋白質得不到及時的轉運、非折疊或錯誤折疊的蛋白在內質網中大量的積聚,又或者受到饑餓、缺氧、藥物影響、鈣離子平衡被打破等各種因素導致的內質網生理功能受損。目前已經證實內質網應激與阿爾茨海默病、糖尿病、腎小管損傷、帕金森氏病、肝臟病毒性損傷和酒精性損傷等眾多疾病的發(fā)生發(fā)展有關。內質網應激促進細胞凋亡的機制主要包括未折疊蛋白反應和鈣離子信號等幾大類。當細胞內鈣離子平衡被嚴重破壞時,細胞質中依賴鈣離子的鈣蛋白酶(calpain)被激活并尋找到內質網膜上的Procaspasel2,將其剪切并活化,隨后通過一系列信號傳導最終導致細胞凋亡程序啟動：當內質網的合成、折疊、修飾蛋白質功能受損而引起大量非折疊和錯誤折疊的蛋白質在內質網內積聚,內質網會啟動一系列補救措施試圖糾正這些錯誤蛋白質,最終會導致內質網合成功能下降、降解能力增強、發(fā)生細胞凋亡等一系列后續(xù)反應,這些由于積聚在內質網內的未經修飾的蛋白和錯誤折疊的蛋白多引發(fā)的反應就是未折疊蛋白反應(UPR)。而當發(fā)生未折疊蛋白反應時,內質網可以通過激活IRE1、ATF6和PERK三條信號傳導通路,此時的內質網會自我保護性的減少新蛋白的翻譯及生成、加強對錯誤折疊蛋白的降解來使自己重新恢復生理平衡,但過度的激活這三條通路都會不可避免的導致細胞啟動凋亡程序泛素化是指在酶促級聯反應的作用下,泛素分子標記在底物蛋白的過程。泛素化參與了細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡、轉錄調節(jié)、損傷修復、炎癥免疫等諸多生命活動。泛素一蛋白酶體途徑是泛素發(fā)揮上述蛋白質降解功能的主要途徑,主要由泛素活化酶E1、泛素結合酶E2以及泛素蛋白連接酶E3、去泛素化酶、26S蛋白酶體構成。機體內的E3主要分為兩大類：RING類E3以及HECT類E3,而目前對HECT類E3研究較多的是Nedd4家族。Nedd4家族在TNF-α、TGF-β以及BMP等多條信號傳導通路中起著不可或缺的調控功能。Smad泛素化調節(jié)因子1(Smurf1)是Nedd4家族中的一員,深入研究Smurf1后發(fā)現其不光在微觀層面對細胞生長和形態(tài)學改變、細胞遷移、細胞極性以及細胞的自我吞噬功能中起著重要的作用并且在骨形成、胚胎發(fā)育以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等宏觀生物學過程中發(fā)揮著重要的生理學功能。2005年時,一篇發(fā)表在Science雜志上的研究中,作者根據從大規(guī)模篩選結果,發(fā)現野生型和酶活突變型Smurf1與IRAK2相互作用預測分值很高,提示我們IRAK2可能和Smurf1以及TGF-B通路存在著交互作用,但究竟其具有何種生理影響等科學問題均未給與解答。白細胞介素1受體相關激酶(IRAKs)是Toll樣受體信號途徑中的關鍵調控分子。IRAK家族包括4個成員：IRAK1、IRAK2、IRAK3 (IRAK-M) 以及 IRAK4。家族成員都含有一個死亡結構域,該結構與、域可以與MyD88死亡結構域相互作用的。IRAK2廣泛存在于各種人體組織中。在Toll樣受體信號通路中,發(fā)揮著承上啟下調控信號傳遞的作用,是固有免疫系統(tǒng)產生免疫反應免疫應答不可缺少的關鍵激酶。我們對IRAK2和Smurf1之間的相互作用、作用方式和意義進行了深入細致的研究。首先我們構建了人源Smurf1和IRAK2的真核表達載體,并且進行了免疫共沉淀相互作用實驗。發(fā)現Smurf1確實可以和IRAK2進行相互作用；隨后通過不同種屬來源的Smurf1和IRAK2的內源抗體檢測,發(fā)現smurf1和IRAK2在內源條件下也是存在相互作用的；并通過共定位和構建Smurf1截短體證實了在細胞中IRAK2與Smurf1是在內質網這一結構上發(fā)生相互作用的；隨后通過相互作用區(qū)域實驗證實Smurf1與IRAK2的相互作用主要是通過HECT結構域來完成的。之后我們通過過量表達實驗卻發(fā)現雖然IRAK2對Smurf1的蛋白水平負調依賴于蛋白酶體途徑,但Smurf1并不是IRAK2的泛素連接酶E3,我們通過用慢病毒載體包裝病毒后構建穩(wěn)定株也顯示敲低IRAK2后Smurf1蛋白水平上調,說明IRAK2對Smurf1的蛋白水平具有負調節(jié)效應,于是我們構建了IRAK2缺失酶活催化結構域的截短體,并進行了磷酸化水平檢測。發(fā)現IRAK2可以明顯的促進smurf1蘇氨酸的磷酸化,并且的確磷酸化發(fā)生在HECT結構域中的Thr114, Thr128, Thr437三個位點的蘇氨酸。結合共定位實驗的結果,我們設想IRAK2對Smurf1的負調控功能可能與內質網的相關功能有聯系。于是檢測了毒胡蘿卜素(Thapsigargin)刺激情況下的IRAK2介導的ER stress通路和smurf1介導的ER stress通路的響應情況,發(fā)現確實IRAK2和Smurf1呈現負相關：隨后我們再次檢測了敲低IRAK2細胞株中Smurf1介導內質網應激的信號通路動態(tài)變化,結果顯示敲低IRAK2的細胞株,Smurf1下游的WFS1以及ATF6的蛋白含量變化,證明IRAK2確實通過Smurf1調節(jié)內質網網應激信號通路。
【關鍵詞】：內質網應激 磷酸化 IRAK2 Smurf1
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 中英文縮略語對照表12-13
• 第一章 前言13-17
• 第一節(jié) 泛素—蛋白酶體途徑13-15
• 第二節(jié) HECT類泛素連接酶及其成員Smurf1的結構15-17
• 第二章 IRAK-2與泛素連接酶Smurf 1之間的相互作用17-27
• 第一節(jié) 背景資料17-21
• 第二節(jié) 材料與方法21-22
• 第三節(jié) 結果與討論22-27
• 第三章 IRAK-2對泛素連接酶Smurf 1在內質網應激中的調控27-36
• 第一節(jié) 背景資料27-31
• 第二節(jié) 材料與方法31
• 第三節(jié) 結果與討論31-36
• 第四章 討論36-39
• 參考文獻39-45
• 附錄45-56
• 附錄1 實驗常用方法詳細流程步驟45-50
• 附錄2 引物的設計與酶切位點設計50-51
• 附錄3 實驗主要使用材料來源、試劑配制及常用儀器設備51-56
• 文獻綜述56-70
• 參考文獻66-70
• 攻讀學位期間發(fā)表文章情況70-71
• 致謝71-72

【相似文獻】

中國碩士學位論文全文數據庫 前1條

1 劉兢文;IRAK2-Smurf1信號軸在內質網應激中的功能研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學院;2015年

  本文關鍵詞：IRAK2-Smurf1信號軸在內質網應激中的功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：374185