本文關(guān)鍵詞：日本血吸蟲(chóng)主要蟲(chóng)卵抗原sjp40的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：血吸蟲(chóng)病是聯(lián)合國(guó)開(kāi)發(fā)計(jì)劃署/世界銀行/世界衛(wèi)生組織聯(lián)合倡議“熱帶病特別規(guī)劃”在全球重點(diǎn)防治的10種熱帶病之一,流行廣泛,是目前仍嚴(yán)重威脅民眾健康的人獸共患寄生蟲(chóng)病。我國(guó)僅流行日本血吸蟲(chóng)病。血吸蟲(chóng)病的主要致病因子是蟲(chóng)卵。血吸蟲(chóng)病的主要病變是成熟蟲(chóng)卵釋放可溶性蟲(chóng)卵抗原(Soluble egg antigen, SEA),激活宿主免疫應(yīng)答系統(tǒng),介導(dǎo)肉芽腫反應(yīng)破壞宿主正常組織。近50年以來(lái),我國(guó)血吸蟲(chóng)病疫情得到有效控制,相關(guān)基礎(chǔ)性研究如日本血吸蟲(chóng)基因組、轉(zhuǎn)錄組、microRNA組學(xué)亦取得系列進(jìn)展,但對(duì)病變組織中蟲(chóng)卵肉芽腫的治愈仍沒(méi)有很好的解決方案。本文以日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵主要抗原Sjp40(Major egg antigen of Schistosoma japonicum, Sjp40)作為研究靶標(biāo)分子,建立日本血吸蟲(chóng)感染新西蘭白兔和BALB/c小鼠模型,一方面利用RNA干擾技術(shù)初步研究該分子對(duì)剛完成雌雄合抱處于配子發(fā)生期的感染后第19天(19 days post-infection,19dpi)組雌雄蟲(chóng)合抱的影響及對(duì)完全性成熟處于產(chǎn)卵高峰期的45 dpi組雌蟲(chóng)產(chǎn)卵量的影響這兩方面的生物學(xué)功能；另一方面取未成熟蟲(chóng)卵沉積但尚未發(fā)生肉芽腫病變的29 dpi新西蘭白兔肝臟組織以及大量成熟蟲(chóng)卵聚集并發(fā)生廣泛肉芽腫急性病變期的45 dpi肝臟組織進(jìn)行Sjp40的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量測(cè)定及免疫熒光定位,并進(jìn)行了初步的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,為解析Sjp40在日本血吸蟲(chóng)病肉芽腫病變的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。一日本血吸蟲(chóng)雌雄蟲(chóng)Sjp40的siRNA干擾及其初步功能研究目的研究日本血吸蟲(chóng)Sjp40基因的體外RNA干擾效應(yīng)；初步觀察Sjp40基因干擾后對(duì)處于配子發(fā)生期(19 dpi組)的雌雄蟲(chóng)合抱率及大量產(chǎn)卵期(45 dpi組)的雌蟲(chóng)產(chǎn)卵量的影響。方法1. 利用http://maidesigner.lifetechnologies.com/maiexpress/網(wǎng)站設(shè)計(jì)、篩選3對(duì)針對(duì)Sjp40基因編碼區(qū)(CDS)的siRNA序列,陰性對(duì)照選用通用siRNA對(duì)照,所有siRNA標(biāo)記FAM熒光。2. 日本血吸蟲(chóng)尾蚴(湖南株)自野生型陽(yáng)性釘螺逸出,采用貼片法經(jīng)腹部感染新西蘭白兔,于感染后第19d(19 dpi)、29d (29 dpi)、34 d (34 dpi)和45 d (45 dpi)剖殺,經(jīng)門靜脈灌注收集成蟲(chóng)。3.成蟲(chóng)經(jīng)PBS (pH7.4)沖洗3次后轉(zhuǎn)入RPMI 1640完全培養(yǎng)基,置5% CO2,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4.收集19 dpi、29dpi、34 dpi和45 dpi以及培養(yǎng)各天數(shù)的雌雄蟲(chóng),備提取總RNA。5.浸泡法轉(zhuǎn)染終濃度為200 nmol/L的siRNA40至19 dpi組雌雄合抱日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng),同步設(shè)立陰性對(duì)照和空白對(duì)照。5% CO2,37℃,干擾3d、5d后,雌雄蟲(chóng)分開(kāi)收集,PBS洗滌3次,備提取RNA。同步觀察并統(tǒng)計(jì)RNA干擾5d后雌雄蟲(chóng)合抱情況。6. 電穿孔法轉(zhuǎn)染終濃度為200 nmol/L的siRNA 40至45 dpi日本血吸蟲(chóng)雌雄合抱成蟲(chóng),同步設(shè)立陰性對(duì)照和空白對(duì)照。RNA干擾48 h后雌雄蟲(chóng)體分開(kāi)收集,經(jīng)PBS (pH7.4)洗滌3次,備提取總RNA。同步在顯微鏡下觀察并比較各組產(chǎn)卵量。7.按Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取日本血吸蟲(chóng)雌蟲(chóng)/雄蟲(chóng)總RNA,經(jīng)DNase Ⅰ消化,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。qRT-PCR檢測(cè)Sjp40基因mRNA的表達(dá)情況。8.分離、獲得45 dpi雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)個(gè)體各20條,分別提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后以RT-PCR擴(kuò)增單個(gè)雌蟲(chóng)/雄蟲(chóng)的Sjp40基因CDS片段,克隆至pEASY-Blunt Cloning Vector中,每條蟲(chóng)體挑取經(jīng)酶切鑒定證實(shí)的3個(gè)克隆,雙向測(cè)序,利用DNAMAN軟件分析Sjp40基因是否存在性別多態(tài)性。9.參考秀麗隱桿線蟲(chóng)RNAi效應(yīng)器成分中各基因名稱及該基因結(jié)構(gòu)域信息,應(yīng)用ncbi,uniprot, interpro, pfam數(shù)據(jù)庫(kù),尋找日本血吸蟲(chóng)的RNAi效應(yīng)器成分。10.用IBM SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPad Prism 5作圖軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中3組以上計(jì)量資料均數(shù)之間的比較用ONEWAY-ANOVA方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間計(jì)量資料均數(shù)比較用Student't -test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),RNA干擾后組間合抱率的比較采用Kruskal-Wallis Test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。p0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.1認(rèn)為差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.日本血吸蟲(chóng)雌雄合抱后的發(fā)育進(jìn)程中,雄蟲(chóng)Sjp40基因的轉(zhuǎn)錄水平在本研究檢測(cè)各點(diǎn)中呈穩(wěn)定性低表達(dá)；雌蟲(chóng)Sjp40基因的轉(zhuǎn)錄水平在本研究檢測(cè)各點(diǎn)中波動(dòng)較大,主要表現(xiàn)在19dpi雌雄合抱成蟲(chóng)體外培養(yǎng)第2d和第3d時(shí),雌蟲(chóng)Sjp40基因的轉(zhuǎn)錄水平處于和雄蟲(chóng)同樣的較低水平,而在培養(yǎng)的第5d和第9dSjp40基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加,29 dpi組、34 dpi組和45 dpi組雌蟲(chóng)Sjp40基因的轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于雄蟲(chóng),且在此較高水平上有一定波動(dòng)。2.浸泡法遞送siRNA干擾19 dpi組雌雄合抱成蟲(chóng)中Sjp40 mRNA表達(dá),干擾效應(yīng)呈現(xiàn)性別差異：以陰性對(duì)照組為基線,雌蟲(chóng)Sjp40 mRNA水平在RNA干擾后的第3d無(wú)顯著下降,第5d下降-60%；而雄蟲(chóng)Sjp40 mRNA水平在RNA干擾后的第3d和第5d均未出現(xiàn)顯著下降。siRNA40干擾組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間的雌雄合抱率在干擾后第5d無(wú)顯著性差異。3.電穿孔法遞送siRNA干擾45 dpi雌雄合抱成蟲(chóng)中Sjp40 mRNA表達(dá),干擾效應(yīng)亦呈現(xiàn)性別差異：以陰性對(duì)照組為基線,雌蟲(chóng)Sjp40 mRNA水平在RNA干擾48 h后下降～55%；而雄蟲(chóng)Sj40 mRNA水平變化在RNA干擾前后無(wú)顯著性差異。顯微鏡下初步觀察到：RNA干擾48 h后,與陰性對(duì)照組相比,siRNA40實(shí)驗(yàn)組的雌蟲(chóng)產(chǎn)卵量明顯減少。4.日本血吸蟲(chóng)雌蟲(chóng)/雄蟲(chóng)各20條的Sjp40基因克隆測(cè)序結(jié)果顯示：Sjp40基因CDS區(qū)高度保守,一致性為100%。5.參照模式生物秀麗隱桿線蟲(chóng),日本血吸蟲(chóng)所具有的RNAi效應(yīng)器成分(小RNA生物合成,dsRNA攝入、擴(kuò)散,放大效應(yīng)蛋白,Argonautes和RISC, RNAi抑制蛋白,核RNAi效應(yīng)器)種類齊全,但每類RNAi效應(yīng)器的數(shù)量減少。結(jié)論1.日本血吸蟲(chóng)雌蟲(chóng)Sjp40轉(zhuǎn)錄水平在19 dpi雌雄合抱成蟲(chóng)體外培養(yǎng)第5d開(kāi)始迅速增加,其后各檢測(cè)點(diǎn)中一直處于高表達(dá),且顯著高于雄蟲(chóng)Sjp40轉(zhuǎn)錄水平。在siRNA40成功降低45 dpi組雌蟲(chóng)Sjp40表達(dá)后,初步觀察到雌蟲(chóng)產(chǎn)卵量明顯減少,提示雌蟲(chóng)Sjp40基因與雌蟲(chóng)產(chǎn)卵密切相關(guān)。2. siRNA40干擾配子發(fā)生期(19 dpi組)雌蟲(chóng)Sjp40基因后,初步發(fā)現(xiàn)雌蟲(chóng)Sjp40與雌雄合抱無(wú)明顯相關(guān)性。3.RNA干擾19 dpi組和45 dpi組雌雄合抱成蟲(chóng),雌、雄蟲(chóng)的Sjp40 RNA干擾效應(yīng)均存在明顯的性別差異。4. Sjp40 RNA干擾效應(yīng)性別差異的發(fā)生與Sjp40基因水平性別多態(tài)性無(wú)關(guān)。二日本血吸蟲(chóng)感染動(dòng)物模型肝臟肉芽腫病變進(jìn)程Sjp40表達(dá)與免疫定位及其初步組學(xué)分析目的觀察Sjp40在感染新西蘭白兔肝臟沉積蟲(chóng)卵及其肉芽腫病變形成中的表達(dá)情況及其免疫定位；對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染動(dòng)物模型肉芽腫病變進(jìn)程中的肝臟組織進(jìn)行初步組學(xué)分析。方法1.日本血吸蟲(chóng)尾蚴(湖南株)自野生陽(yáng)性釘螺逸出,采用貼片法經(jīng)腹部感染新西蘭白兔和BALB/c、鼠,于感染后第29 d和45 d剖殺,收集未感染組、29dpi組和45 dpi組肝臟,未感染肝臟作為空白對(duì)照。2.液氮快速研磨上述各期新西蘭白兔和BALB/c小鼠肝臟成粉末狀后,分別加入Trizol,按TRIzol法提取各期肝臟總RNA,經(jīng)DNase Ⅰ消化,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-qPCR檢測(cè)各期兔肝臟中Sjp40基因mRNA的表達(dá)。各期BALB/c小鼠肝臟RNA送公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；3.同步提取各期新西蘭白兔肝臟可溶性總蛋白(total soluble protein, TSP).以硫酸銨鹽析法和Protein G免疫親和柱層析法純化抗Sjpp40-McAb 9G7(檢測(cè)抗體)和抗弓形蟲(chóng)tSAGl-McAb Y3A8(陰性對(duì)照抗體),Western-blot檢測(cè)Sjp40蛋白的表達(dá)。4.制備各期新西蘭白兔肝臟石蠟切片,HE染色觀察肝臟中蟲(chóng)卵肉芽腫的形成與發(fā)展,進(jìn)一步以間接免疫熒光技術(shù)進(jìn)行Sjp40在肝臟沉積蟲(chóng)卵及肉芽腫組織中的定位。5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,用IBM SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,29 dpi組和45 dpi組兩組兔肝臟沉積蟲(chóng)卵間Sjp40的mRNA表達(dá)水平差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.日本血吸蟲(chóng)感染兔呈急性肝肉芽腫病變期的45 dpi肝臟沉積蟲(chóng)卵中Sjp40mRNA水平顯著高于29 dpi尚未形成蟲(chóng)卵肉芽腫結(jié)節(jié)的肝臟沉積的未成熟蟲(chóng)卵(P0.05)。2.抗Sjp40-McAb 9G7特異性檢測(cè)到Sjp40蛋白在29 dpi和45 dpi新西蘭白兔肝臟中的表達(dá)。3.HE染色片觀察顯示29 dpi新西蘭白兔肝臟中蟲(chóng)卵極少,且皆為未成熟蟲(chóng)卵,尚未見(jiàn)蟲(chóng)卵肉芽腫形成,但肝臟已有輕微病變；45 dpi新西蘭白兔肝臟中則顯示有成熟蟲(chóng)卵大量成簇沉著,蟲(chóng)卵肉芽腫廣泛分布。4.間接免疫熒光結(jié)果顯示：Sjp40在29 dpi新西蘭白兔肝臟中定位于未成熟蟲(chóng)卵內(nèi),而45 dpi,可見(jiàn)感染新西蘭白兔肝臟中沉積的大量成簇內(nèi)含毛蚴的成熟蟲(chóng)卵及其周圍肉芽腫組織均有明顯熒光。5.轉(zhuǎn)錄組學(xué)初步結(jié)果顯示：29 dpi BALB/c小鼠肝臟比對(duì)到小鼠基因組(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads.html#mouse)和日本血吸蟲(chóng)基因組(http://lifecenter.sgst.cn/schistosoma/cn/schdownload.do)的mapped reads分別為105,021,590(91.47%)和43,117(1.5%)條。測(cè)序共獲得日本血吸蟲(chóng)已知轉(zhuǎn)錄本為4238個(gè),新轉(zhuǎn)錄本為221個(gè)。其中測(cè)序深度大于10且表達(dá)量大于500的日本血吸蟲(chóng)已知轉(zhuǎn)錄本為10個(gè),其中Sjp40表達(dá)量居首位。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,用IBM SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析,29 dpi組和45 dpi組兩組兔肝臟沉積蟲(chóng)卵間Sjp40的mRNA表達(dá)差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論1.Sjp40在日本血吸蟲(chóng)感染兔肝臟中的表達(dá)量隨蟲(chóng)卵發(fā)育成熟而顯著增加,并由蟲(chóng)卵擴(kuò)散至其周圍肉芽腫組織,提示該分子在血吸蟲(chóng)肉芽腫的形成與發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。2.29 dpi BALB/c小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)初步分析結(jié)果顯示,Sjp40在測(cè)序深度大于10且表達(dá)量大于500的轉(zhuǎn)錄本中呈最高量表達(dá),進(jìn)一步提示Sjp40應(yīng)在29 dpiBALB/c小鼠肝臟沉積蟲(chóng)卵中扮演重要角色。
【關(guān)鍵詞】：日本血吸蟲(chóng) Sjp40 RNA干擾 蟲(chóng)卵肉芽腫 免疫熒光定位 組學(xué)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R383.24
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-22
• 第一章 日本血吸蟲(chóng)雌雄蟲(chóng)主要蟲(chóng)卵抗原Sjp40的siRNA干擾及其初步功能研究22-46
• 1 材料22-25
• 2 方法25-35
• 3 結(jié)果35-42
• 4 討論42-46
• 第二章 日本血吸蟲(chóng)感染動(dòng)物模型肝臟肉芽腫病變進(jìn)程Sjp40表達(dá)與免疫定位及肝臟初步組學(xué)分析46-67
• 1 材料46-48
• 2 方法48-53
• 3 結(jié)果53-64
• 4 討論64-67
• 全文小結(jié)67-68
• 參考文獻(xiàn)68-74
• 附錄74-76
• 碩士期間論文發(fā)表情況76-77
• 致謝77-78

【共引文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：日本血吸蟲(chóng)主要蟲(chóng)卵抗原sjp40的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：373086