發(fā)布時(shí)間：2017-05-17 08:12

  本文關(guān)鍵詞：DLL1在BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化的作用及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, MSCs)是成體干細(xì)胞中的一種,具有多項(xiàng)分化潛能和較強(qiáng)的自我更新能力,同時(shí)又因?yàn)槠渚哂幸子诜蛛x培養(yǎng)和取材方便等特點(diǎn),因此可作為骨科疾病治療、修復(fù)受損骨以及組織工程中完美的再生細(xì)胞。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)具有能夠誘導(dǎo)MSCs向成骨分化的能力,其中BMP9是目前研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)成骨能力最強(qiáng)。Notch信號(hào)通路廣泛存在于脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物等多種動(dòng)物體內(nèi),是一條保守的信號(hào)通路,在生物胚胎期以及出生后的整個(gè)發(fā)育過程中都發(fā)揮著重要調(diào)控作用。對(duì)多種細(xì)胞系的增殖、分化、凋亡、粘附以及表皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化都有一定調(diào)控作用。有研究證實(shí),在MSCs成骨分化過程,Notch信號(hào)通路參與了調(diào)控作用。課題組前期研究證明,Notch信號(hào)通路能夠促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)MSCs向成骨分化,但具體機(jī)制尚未明確。DLL1是Notch信號(hào)通路的一種配體,目前有研究報(bào)道,在膠質(zhì)瘤中,DLL1可能通過阻滯細(xì)胞分化來促進(jìn)細(xì)胞增殖；但在黑色素瘤中,DLL1能夠調(diào)節(jié)胚胎動(dòng)靜脈分化以及成體損傷后的血管再生與修復(fù)。但目前還沒有研究報(bào)道DLL1對(duì)成骨分化作用的具體影響與機(jī)制。第一部分實(shí)驗(yàn)主要研究目的：探究DLL1在BMP9誘導(dǎo)MSCs向成骨分化的作用；研究發(fā)現(xiàn)DLL1促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化；在這個(gè)過程中,DLL1明顯上調(diào)BMP9的受體ALK2表達(dá),而BMP9其余受體并沒有明顯變化；同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT和dnNotch1作用后都出現(xiàn)同樣的調(diào)節(jié)ALK2表達(dá)的現(xiàn)象。因此,我們?cè)诘诙糠种匮芯?Notch信號(hào)通路是否通過上調(diào)ALK2影響B(tài)MP9誘導(dǎo)MSCs的成骨分化。第一部分DLL1在BMP9誘導(dǎo)MSGs成骨分化中的作用目的：了解Notch配體Delta-like1(DLL1)在BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化的作用及可能機(jī)制。方法：采用重組腺病毒分別上調(diào)BMP9,及DLL1,采用細(xì)胞化學(xué)染色分別檢測早期成骨指標(biāo)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和晚期成骨指標(biāo)茜素紅染色,了解DLL1在體外對(duì)BMP9誘導(dǎo)的成骨分化的影響；同時(shí),通過裸鼠異位成骨實(shí)驗(yàn),mcroCT和HE染色,分析DLL1在體內(nèi)對(duì)BMP9誘導(dǎo)成骨分化的作用。另一方面,qRT-PCR檢測BMP9受體的表達(dá)情況,Western檢測p-Smad1/5/9和熒光素報(bào)告酶檢測Smad結(jié)合元件(Smad-binding element, SBE)活性,分別從胞膜、胞漿和胞核三個(gè)水平了解DLL1對(duì)BMP9信號(hào)通路的影響,以了解DLL1促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)成骨分化的可能機(jī)制。結(jié)果：DLL1處理組與對(duì)照組相比,前者在體外能明顯促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)的MSCs的ALP及鈣鹽沉積；在體內(nèi)亦能促進(jìn)裸鼠皮下成骨；在這一過程中,DLL1處理后,BMP9的受體ALK2明顯上調(diào)；Smad1/5/8蛋白總量沒有改變,p-Smad1/5/9蛋白表達(dá)水平升高,而SBE活性也有升高(P0.05)。結(jié)論：DLL1在體內(nèi)外都能夠促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨能力；在細(xì)胞膜、細(xì)胞漿及細(xì)胞核三個(gè)水平,對(duì)BMP9-Smad經(jīng)典信號(hào)通路都有作用。第二部分Notch信號(hào)通路通過上調(diào)ALK2促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化目的：了解Notch信號(hào)通路是否是通過上調(diào)BMP9受體ALK2促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化作用。方法：分別采用重組腺病毒DLL1和BMP9上調(diào)Notch和BMP9, DAPT和重組腺病毒dnNotch1下調(diào)Notch,重組腺病毒siALKl和2下調(diào)ALK1和ALK2。分組處理MSCs細(xì)胞后,RT-PCR/qRT-PCR檢測受體表達(dá)情況；細(xì)胞化學(xué)法檢測早晚期成骨指標(biāo)；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期以及凋亡情況；Edu檢測細(xì)胞增殖。結(jié)果：BMP9誘導(dǎo)成骨過程中,上調(diào)/下調(diào)Notch,能引起ALK2,而不是ALK1表達(dá)量的變化；DLL1能逆轉(zhuǎn)由于干擾ALK2導(dǎo)致的早晚期成骨分化指標(biāo)的減弱,但對(duì)siALK1處理組沒有影響；流式細(xì)胞分析和Edu實(shí)驗(yàn)顯示DLL1能逆轉(zhuǎn)由于干擾ALK2導(dǎo)致的減少的細(xì)胞增殖(P0.05),而對(duì)siALK1處理組沒有影響；但對(duì)細(xì)胞凋亡并無明顯影響。結(jié)論：在BMP9誘導(dǎo)的成骨分化過程中,Notch信號(hào)通路可能通過上調(diào)ALK2的表達(dá),影響細(xì)胞增殖,從而促進(jìn)MSCs成骨分化。
【關(guān)鍵詞】：Notch信號(hào)通路 ALK2 間充質(zhì)干細(xì)胞 成骨分化
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對(duì)照5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-15
• 技術(shù)路線15-16
• 前言16-18
• 第一部分 DLL1在BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化中的的作用18-31
• 1 材料與方法18-27
• 2 結(jié)果27-31
• 3 討論31
• 第二部分 Notch信號(hào)通路通過上調(diào)ALK2促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化31-41
• 1 材料與方法31-35
• 2 結(jié)果35-40
• 3 討論40-41
• 全文總結(jié)41-42
• 文獻(xiàn)綜述42-53
• 參考文獻(xiàn)47-53
• 致謝53-54
• 碩士在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文54

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9 李R既，

本文編號(hào)：372864