旋毛蟲是一種主要的食源性寄生線蟲,旋毛蟲病主要是由于生食或半生食含旋毛蟲囊包的肉制品從而感染。旋毛蟲成蟲寄生在宿主的小腸內,但幼蟲侵入腸黏膜的機制尚不完全清楚。蛋白酶能夠催化蛋白質多肽鏈的水解,而在寄生蟲體內分泌的有多種功能的蛋白酶,在寄生蟲的侵入與致病過程有著重要的作用。旋毛蟲絲氨酸蛋白酶Ts SP1.2和絲氨酸抑制因子Ts SPI是從旋毛蟲排泄-分泌物（excretory-secretory,ES）中獲得的。實驗室前期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Ts SP1.2（Gen Bank Accession No.:EU302800）和Ts SPI抑制因子（Gen Bank accession no.XP₀03377380.1）均可能參與了旋毛蟲感染性幼蟲侵入小腸上皮細胞（IEC）。RNA干擾（RNA interference,RNAi）是指在生物進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA,ds RNA）誘發(fā)的、同源m RNA高效特異性降解的現(xiàn)象[1]。本研究的目的是通過RNAi確定Ts SP1.2和Ts SPI在旋毛蟲幼蟲侵襲和生長發(fā)育中的作用。將特異性... 

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮略詞表(Abbreviations)
1 前言
    1.1 旋毛蟲與旋毛蟲病
    1.2 RNA干擾技術
    1.3 TsSP1.2的研究
    1.4 TsSPI基因
    1.5 研究意義
2 材料
    2.1 主要試劑
    2.2 主要儀器
    2.3 實驗動物、旋毛蟲蟲種及所用細胞
    2.4 主要試劑的配制
3 方法
    3.1 技術路線
    3.2 菌種的活化,蛋白的誘導表達
    3.3 蛋白的純化
    3.4 純化蛋白的濃度測定
    3.5 ELASA法檢測蛋白抗血清的效價
    3.6 siRNA的設計和合成
    3.7 蟲體可溶的提取
    3.8 Weastern blot
    3.9 提取旋毛蟲肌幼蟲RNA
    3.10 RNA反轉錄樣本cDNA
    3.11 RT-PCR驗證c DNA質量
    3.12 Real-time PCR
    3.13 RNAi的基因特異性
    3.14 RNAi后旋毛蟲肌幼蟲在體外的存活率
    3.15 RNAi后對侵入IECs的影響
    3.16 RNAi對于旋毛蟲肌幼蟲侵入腸粘膜及其發(fā)育影響
    3.17 數(shù)據(jù)處理
4 結果
    4.1 應用RNAi對TsSP1.2蛋白的研究
        4.1.1 siRNA的設計合成
        4.1.2 siRNA轉染到旋毛蟲肌幼蟲體內
        4.1.3 qPCR驗證si RNA對TsSP1.2基因轉錄水平的影響
        4.1.4 Western blotting蛋白水平檢測RNAi對TsSP1.2表達量變化
        4.1.5 TsSP1.2基因沉默后肌幼蟲體外存活及侵入IECs情況
        4.1.6 TsSP1.2基因沉默后對肌幼蟲侵入腸粘膜、發(fā)育及雌蟲生殖力的影響
        4.1.7 siRNA-534處理后對各蟲期蟲體形態(tài)大小的影響
        4.1.8 RNAi的基因特異性
    4.2 應用RNAi對TsSPI蛋白的研究
        4.2.1 siRNA的設計合成
        4.2.2 siRNA轉染到旋毛蟲肌幼蟲體內
        4.2.3 qPCR驗證RNAi對TsSPI轉錄水平的影響
        4.2.4 Western blotting驗證si RNA對TsSPI蛋白水平的表達量變化
        4.2.5 TsSPI基因沉默后肌幼蟲體外存活及侵入IECs
        4.2.6 TsSPI基因沉默后對肌幼蟲侵入腸粘膜、發(fā)育及雌蟲生殖力的影響
        4.2.7 siRNA-653處理后對各蟲期蟲體形態(tài)大小的影響
5 討論
6 結論
參考文獻
綜述
    參考文獻
個人簡歷
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]應用RNA干擾技術對旋毛蟲Ts87基因功能的初步研究[J]. 郝冉,楊雅平,楊靜,王少華,諸欣平.  寄生蟲與醫(yī)學昆蟲學報. 2008(01)



本文編號：3716310