本文關(guān)鍵詞：惡性瘧原蟲中含EEP結(jié)構(gòu)域的DNase的表達(dá)與功能鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：瘧疾依然是世界范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問題之一,每年超過100萬人死于瘧疾,其中大部分為五歲以下的兒童。瘧疾的病原體是瘧原蟲,是一種營(yíng)寄生生活的原蟲。在人體內(nèi)無性生殖階段中,瘧原蟲大量復(fù)制和反復(fù)入侵紅細(xì)胞造成了瘧疾的發(fā)病。脫氧核糖核酸酶(DNase)是參與生物體DNA復(fù)制、修復(fù)和重組等生理活動(dòng)的重要蛋白質(zhì),同時(shí)也在病原體免疫逃避過程中發(fā)揮重要功能。EEP結(jié)構(gòu)域能夠水解DNA中的磷酸二酯鍵,是DNase降解DNA發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)域之一。惡性瘧原蟲PF3D7_1238600、PF3D7_0107200、PF3D7_0305600、PF3D7_0319200和PF3D7_1363500蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)含有EEP結(jié)構(gòu)域,且未見相關(guān)研究報(bào)道。首先,以Seryl-t RNA合成酶基因?yàn)閮?nèi)參基因,利用熒光定量PCR技術(shù)分析了PF3D7_1238600、PF3D7_0107200、PF3D7_0305600、PF3D7_1363500和PF3D7_0319200基因在惡性瘧原蟲3D7株紅細(xì)胞內(nèi)期不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄情況,并比較了目的基因之間的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示目的基因在惡性瘧原蟲3D7株整個(gè)紅內(nèi)期全程轉(zhuǎn)錄,并在滋養(yǎng)體和裂殖體期達(dá)到高峰;目的基因間轉(zhuǎn)錄差異較大,其中PF3D7_1238600基因整體轉(zhuǎn)錄水平最高,PF3D7_0107200基因整體轉(zhuǎn)錄水平最低。然后,通過對(duì)目的DNase氨基酸序列的親水性分析,選取親水好的區(qū)域進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的原核表達(dá)與純化,并免疫家兔制備多克隆抗體。以制備的多克隆抗體為一抗,通過Western blot檢測(cè)蟲體天然蛋白的表達(dá),用間接免疫熒光對(duì)蟲體天然蛋白質(zhì)進(jìn)行定位。結(jié)果顯示,目的DNase在惡性瘧原蟲3D7株紅細(xì)胞內(nèi)期均有表達(dá)。間接免疫熒光分析顯示,PF3D7_0319200蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞核,PF3D7_1238600、PF3D7_0305600和PF3D7_1363500蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞核周圍,PF3D7_0107200蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)。進(jìn)一步將目的DNase的EEP結(jié)構(gòu)域進(jìn)行原核表達(dá),進(jìn)行體外DNA降解實(shí)驗(yàn)以確定其DNase活性。結(jié)果顯示,PF3D7_1363500和PF3D7_0107200蛋白質(zhì)為非金屬離子依賴性脫氧核糖核酸內(nèi)切酶,PF3D7_0305600和PF3D7_0319200蛋白質(zhì)為Mg2+/Mn2+依賴性脫氧核酸酶內(nèi)切酶,PF3D7_1238600蛋白質(zhì)為Cu2+依賴性脫氧核糖核酸酶外切酶。本研究通過對(duì)目的DNase的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)、亞細(xì)胞定位和功能的鑒定,為揭示目的DNase在瘧原蟲體內(nèi)的功能和瘧疾的治療奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：惡性瘧原蟲 DNase EEP結(jié)構(gòu)域 DNA降解
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R382.31
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述12-19
• 第1章 瘧原蟲的脫氧核糖核酸酶的研究12-19
• 1.1 瘧疾概述12-13
• 1.2 脫氧核糖核酸酶13-15
• 1.3 瘧原蟲中的脫氧核糖核酸酶15-18
• 展望18-19
• 第二篇 研究?jī)?nèi)容19-62
• 第1章 熒光定量PCR分析目的DNase基因在惡性瘧原蟲3D7株紅內(nèi)期的轉(zhuǎn)錄規(guī)律19-28
• 1.1 材料19-20
• 1.2 方法20-24
• 1.3 結(jié)果24-26
• 1.4 討論26-27
• 1.5 小結(jié)27-28
• 第2章 目的DNase重組蛋白質(zhì)的表達(dá)純化和多克隆抗體的制備28-45
• 2.1 材料28-31
• 2.2 方法31-37
• 2.3 結(jié)果37-43
• 2.4 討論43-44
• 2.5 小結(jié)44-45
• 第3章 惡性瘧原蟲3D7株目的DNase在紅內(nèi)期的表達(dá)和定位45-51
• 3.1 材料45-46
• 3.2 方法46-47
• 3.3 結(jié)果47-49
• 3.4 討論49-50
• 3.5 小結(jié)50-51
• 第4章 惡性瘧原蟲3D7株目的DNase的功能鑒定51-62
• 4.1 材料51-52
• 4.2 方法52-54
• 4.3 結(jié)果54-60
• 4.4 討論60-61
• 4.5 小結(jié)61-62
• 結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-71
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文71-72
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介72-73
• 作者簡(jiǎn)介73-74
• 致謝74

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本文編號(hào)：359627