發(fā)布時(shí)間：2017-05-12 00:03

  本文關(guān)鍵詞：Zmp1的克隆表達(dá)及其對(duì)巨噬細(xì)胞的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目 的：構(gòu)建分枝桿菌鋅離子依賴的金屬蛋白酶1(zmp1)基因的原核表達(dá)載體,在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá),對(duì)Zmp1重組融合蛋白進(jìn)行純化；構(gòu)建分枝桿菌zmpl基因與增強(qiáng)型的綠色熒光蛋白(EGFP)融合的真核表達(dá)載體,驗(yàn)證其在RAW264.7細(xì)胞中的表達(dá)；探討Zmpl蛋白對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖活性、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及吞噬體-溶酶體融合的影響。方法：1.以卡介苗(BCG)基因組DNA為模板,采用PCR法擴(kuò)增zmp1基因；定向克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(+)的多克隆位點(diǎn)中,構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET-32a(+)-zmpl；轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),純化獲取Zmpl重組蛋白,表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot鑒定。2.以BCG基因組DNA為模板,采用PCR法擴(kuò)增zmp1基因；定向克隆到真核表達(dá)載體pEGFP-N1的多克隆位點(diǎn)中,構(gòu)建重組真核表達(dá)載體p EGFP-N1-zmpl,并轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá),實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)zmpl基因mRNA的表達(dá)水平。3.用Zmpl重組蛋白作用RAW264.7細(xì)胞后24h, CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活力；作用后48 h,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的周期和凋亡4.將載體pEGFP-N1-zmpl瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞后24h,CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活力；轉(zhuǎn)染后48 h,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的周期和凋亡。5.減毒鼠傷寒沙門氏菌(SL7207)感染RAW264.7細(xì)胞(已轉(zhuǎn)染載體pEGFP-N1-Zmpl或Zmpl重組蛋白作用),采用沙門氏菌熒光抗體和溶酶體相關(guān)膜蛋白標(biāo)志物熒光抗體雙標(biāo)記,通過(guò)熒光顯微鏡觀察Zmpl蛋白阻止吞噬體-溶酶體融合的作用。結(jié)果：1.PCR法擴(kuò)增出zmp1基因；定向克隆構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET一32a(+)-zmpl經(jīng)雙酶切及基因測(cè)序鑒定構(gòu)建正確；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)出重組Zmpl融合蛋白,相對(duì)分子量約為94 kDa,大小與預(yù)期融合蛋白相符；Western blot結(jié)果顯示重組Zmpl融合蛋白可與His標(biāo)簽單克隆抗體特異性結(jié)合。2.PCR法擴(kuò)增出zmp1基因；定向克隆構(gòu)建的真核表達(dá)載體pEGFP-N1-zmpl,經(jīng)雙酶切及基因測(cè)序鑒定構(gòu)建正確；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的RAW264.7細(xì)胞中觀察到綠色熒光表達(dá)；qRT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-zmpl的RAW264.7田胞zmp1的表達(dá)顯著升高。3.采用Zmpl重組蛋白細(xì)胞外作用RAW264.7細(xì)胞,在24-96 h觀察到細(xì)胞增殖活力有所下降；細(xì)胞周期在S期被阻滯；早期細(xì)胞凋亡率和晚期細(xì)胞凋亡率均有所增加。4.將載體pEGFP-N1-zmpl轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞,在48～96 h觀察到細(xì)胞增殖活力有所下降；細(xì)胞周期在S期和G2期被阻滯；早期細(xì)胞凋亡率有所增加。5.Zmpl重組蛋白組和pEGFP-N1-zmpl細(xì)胞轉(zhuǎn)染組,雙熒光融合數(shù)量變化不大,影響吞噬體-溶酶體融合差異不明顯。結(jié)論：1.成功構(gòu)建了zmpl基因原核表達(dá)載體,并在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得重組Zmpl融合蛋白表達(dá)。2.成功構(gòu)建了zmp1基因真核表達(dá)載體,并在RAW264.7細(xì)胞中獲得重組Zmpl融合蛋白表達(dá)。3.Zmp1蛋白能夠抑制RAW264.7細(xì)胞的增殖活性、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡,影響吞噬體-溶酶體融合效果不明顯,為重組BCG疫苗的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：Zmp1 增殖 凋亡 吞噬體一溶酶體 RAW264.7細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 英漢縮略詞名詞對(duì)照5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-15
• 第一部分 zmp1基因原核表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)鑒定15-30
• 1 材料與方法15-26
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-28
• 3 討論28-29
• 4 小結(jié)29-30
• 第二部分 zmp1基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及在巨噬細(xì)胞中表達(dá)30-41
• 1 材料與方法30-37
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-39
• 3 討論39-40
• 4 小結(jié)40-41
• 第三部分 Zmp1對(duì)巨噬細(xì)胞影響的初步研究41-52
• 1 材料與方法41-45
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-48
• 3 討論48-51
• 4 小結(jié)51-52
• 全文小結(jié)52-54
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 文獻(xiàn)綜述59-69
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 致謝69-70
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文70

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