目的優(yōu)化建立適合本實(shí)驗(yàn)室針對(duì)人源福爾馬林固定石蠟包埋（Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded,FFPE）樣本的全基因組（Genomic DNA,gDNA）文庫(kù)構(gòu)建方案。方法探討并設(shè)計(jì)了在FFPE全基因組文庫(kù)構(gòu)建各環(huán)節(jié)優(yōu)化條件,分析比較FFPE DNA文庫(kù)片段大小及文庫(kù)轉(zhuǎn)化率,以選擇最優(yōu)的文庫(kù)構(gòu)建流程。結(jié)果最終確定DNA起始量50 ng、20 min片段化酶切時(shí)間,采用4×稀釋的接頭進(jìn)行20 min連接,經(jīng)過(guò)2次特定比例的磁珠篩選方案進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建,實(shí)現(xiàn)片段主峰在300 bp～400 bp左右,文庫(kù)轉(zhuǎn)化率達(dá)60%。結(jié)論本操作流程針對(duì)FFPE樣本可以保證高質(zhì)量的文庫(kù)構(gòu)建,同時(shí)實(shí)現(xiàn)較高文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率。 

【文章來(lái)源】：中華臨床實(shí)驗(yàn)室管理電子雜志. 2020,8(02)

【文章頁(yè)數(shù)】：8 頁(yè)

【部分圖文】：

文庫(kù)構(gòu)建流程示意圖

本實(shí)驗(yàn)測(cè)試采用酶切打斷的方式進(jìn)行FFPE片段化。我們首先針對(duì)連接產(chǎn)物片段化篩選的方案,實(shí)驗(yàn)設(shè)置同一標(biāo)本(編號(hào)236,濃度6.8 ng/μL),50 ng起始量,按常規(guī)流程進(jìn)行片段化酶切時(shí)間15 min、接頭稀釋倍數(shù)1×、連接時(shí)間20 min情況下,分4種不同片段篩選方案進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建,通過(guò)2100檢測(cè)觀察片段化大小范圍,以及通過(guò)計(jì)算文庫(kù)實(shí)際得量來(lái)評(píng)估文庫(kù)的轉(zhuǎn)化率。本次測(cè)試基于連接產(chǎn)物PCR后對(duì)文庫(kù)轉(zhuǎn)化率進(jìn)行評(píng)估,并定義起始量×0.75(片段化損耗)×0.75 n(篩選次數(shù)損耗)×1.9^8 cycle為本次測(cè)試的理論得量,實(shí)際得量為Qubit所測(cè)。(2)接頭濃度優(yōu)化

DNA濃度(質(zhì)量)反映文庫(kù)主峰及轉(zhuǎn)化率關(guān)系

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]甲醛固定石蠟包埋標(biāo)本不同二代測(cè)序平臺(tái)性能比較[J]. 姜瑞瑞,王亞健,滕曉東,肖林,步宏,葉豐.  中華病理學(xué)雜志. 2018 (08)
[2]靶向二代測(cè)序檢測(cè)結(jié)直腸癌腸鏡活檢標(biāo)本的可行性分析[J]. 王亞健,姜瑞瑞,劉海靜,張波,葉豐,步宏.  中華病理學(xué)雜志. 2018 (07)



本文編號(hào)：3585428