目的優(yōu)化建立適合本實驗室針對人源福爾馬林固定石蠟包埋（Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded,FFPE）樣本的全基因組（Genomic DNA,gDNA）文庫構(gòu)建方案。方法探討并設(shè)計了在FFPE全基因組文庫構(gòu)建各環(huán)節(jié)優(yōu)化條件,分析比較FFPE DNA文庫片段大小及文庫轉(zhuǎn)化率,以選擇最優(yōu)的文庫構(gòu)建流程。結(jié)果最終確定DNA起始量50 ng、20 min片段化酶切時間,采用4×稀釋的接頭進(jìn)行20 min連接,經(jīng)過2次特定比例的磁珠篩選方案進(jìn)行文庫構(gòu)建,實現(xiàn)片段主峰在300 bp～400 bp左右,文庫轉(zhuǎn)化率達(dá)60%。結(jié)論本操作流程針對FFPE樣本可以保證高質(zhì)量的文庫構(gòu)建,同時實現(xiàn)較高文庫轉(zhuǎn)化效率。 

【文章來源】：中華臨床實驗室管理電子雜志. 2020,8(02)

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

文庫構(gòu)建流程示意圖

本實驗測試采用酶切打斷的方式進(jìn)行FFPE片段化。我們首先針對連接產(chǎn)物片段化篩選的方案,實驗設(shè)置同一標(biāo)本(編號236,濃度6.8 ng/μL),50 ng起始量,按常規(guī)流程進(jìn)行片段化酶切時間15 min、接頭稀釋倍數(shù)1×、連接時間20 min情況下,分4種不同片段篩選方案進(jìn)行文庫構(gòu)建,通過2100檢測觀察片段化大小范圍,以及通過計算文庫實際得量來評估文庫的轉(zhuǎn)化率。本次測試基于連接產(chǎn)物PCR后對文庫轉(zhuǎn)化率進(jìn)行評估,并定義起始量×0.75(片段化損耗)×0.75 n(篩選次數(shù)損耗)×1.9^8 cycle為本次測試的理論得量,實際得量為Qubit所測。(2)接頭濃度優(yōu)化

DNA濃度(質(zhì)量)反映文庫主峰及轉(zhuǎn)化率關(guān)系

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]甲醛固定石蠟包埋標(biāo)本不同二代測序平臺性能比較[J]. 姜瑞瑞,王亞健,滕曉東,肖林,步宏,葉豐.  中華病理學(xué)雜志. 2018 (08)
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本文編號：3585428